Assembly of the Bacterial Flagellum : How Salmonella Exports Flagellar Proteins and Controls Hook Length

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Zusammenfassung

Bacteria propel themselves through liquid environments using rotation of a propeller like organelle, the flagellum. Flagella are energized by the membrane ion gradient and enable bacteria to swim towards nutrients and away from harmful substances. This unique nanomachine shares structural and functional similarities to the needle-like injectisome complex that pathogenic bacteria employ to inject virulence factors into eukaryotic host cells. Bacterial flagella and injectisomes contain a specialized protein export system, termed ’type III secretion’, that functions to deliver structural subunits and effector proteins to the outside of the cytoplasmic membrane. Type III secretion systems are made of multiple proteins, however, the function of individual subunits and the molecular mechanism of protein translocation is poorly understood.
The first part of this thesis reports that the flagellar type III secretion system functions as a proton-driven protein exporter and demonstrates that many components of the apparatus have a facilitating role and are dispensable for the actual protein translocation process. Treatment with a protonophore that disrupts the membrane proton gradient of the cell prevented export of flagellar substrates. In a mutant strain deleted for the flagellar-specific ATPase FliI, we observed weak swarming motility and rare formation of flagella. Hydrolysis of ATP had been considered to provide energy for protein translocation via the flagellar type III export apparatus but these findings demonstrate that flagellar secretion in Salmonella enterica requires the proton motive force while ATP hydrolysis is not essential.
For efficient export function of the flagellar type III secretion system, six integral membrane proteins (FliOPQR FlhAB), three soluble proteins (FliHIJ) and the rotor- switch complex (FliGMN) are needed. We sought mutants that allowed for export of a model substrate into the periplasm in the absence of the rotor-switch complex, the C-ring. We isolated mutants in known and unknown flagellar regulatory loci that resulted in at least two-fold increased expression of the flagellar master operon, flhDC. The increased flhDC expression coincided with elevated levels of hook-basal-body formation. These results indicate that the C-ring functions primarily as the rotor of the flagellum and provides a secondary, facilitating role during type III secretion as a affinity cup-like structure that enhances the specificity and efficiency of the export process.
We next measured export of a flagellar-specific model substrate in a battery of export-apparatus mutants. Export of a hook-β-lactamase fusion protein into the periplasm confers quantifiable ampicillin resistance. We found that the soluble components of the flagellar type III secretion system, the cytoplasmic C-ring and the membrane protein FliO are dispensable for export. Overexpression of a single membrane protein, FliP, resulted in significant export of the reporter substrate, indicating that FliP forms the central channel of the secretion apparatus. Finally, we present the first molecular-level hypothesis for the organization and mechanism of the flagellar type III secretion system.
For efficient transmission of rotational energy from the flagellar basal-body to the rigid, extracellular filament, a flexible coupling structure is needed. The length of this flexible joint, the hook, is tightly controlled in Salmonella enterica by an intrinsic control mechanism. A molecular ruler, FliK, measures the length of the hook and transmits this information back to the FlhB component of the secretion apparatus at the base of the flagellum. Here, an interaction between the carboxy-terminus of FliK and FlhB induces a specificity switch in the flagellar type III secretion apparatus from secretion of rod- hook-type substrates to secretion of late substrates, including the filament subunits. Several models for the mechanism of length control have been proposed, including a ’static ruler’ and a ’measuring cup’, while failing to explain all published data on hook length control.
The second part of this thesis reports that FliK acts as an infrequent molecular ruler that is intermittently secreted during hook polymerization. We refuted the previous ’cup model’ for flagellar hook length control by demonstrating normal hook length control in the absence of the rotor-switch complex that was thought to act as a ’measuring cup’. FliK deletion variants that were previously reported to control hook length without secretion were in fact secreted. By uncoupling hook polymerization from FliK expression, we demonstrated that secreted FliK immediately triggers the specificity switch if the ruler is secreted in elongated hooks greater than the physiological length. The probability of a productive interaction of FliK with FlhB, which results in the specificity switch, is an increasing function of hook length. The experimental hook length data displayed excellent agreement with a mathematical model of the Infrequent Ruler hypothesis. Finally, the velocity of FliK secretion correlated inversely with hook length, which provides a possible molecular mechanism for hook length control by FliK.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Bakterien benutzen die Rotation eines Propeller-ähnlichen Organelles, dem Flagellum, zur Fortbewegung in flüssiger Umgebung. Das Flagellum ermöglicht Bakterien zu Nährstoffen und weg von schädlichen Substanzen zu schwimmen. Die Rotation des Flagellums wird durch den Ionengradienten der Membran energetisiert. Das bakterielle Flagellum ist eine einzigartige Maschine im Nanomaßstab und vereint strukturelle und funktionelle Gemeinsamkeiten mit dem Injektisomkomplex von pathogenen Bakterien. Dieser Nadel-ähnliche Komplex wird von vielen Gram-negativen Bakterien verwendet um Virulenzfaktoren in eukaryontische Wirtszellen zu injizieren. Das Flagellum und der Injektisomkomplex beinhalten beide ein spezielles Proteintransportsystem, das sogenannte ’Typ III Sekretionssystem’. Dieser Transportapparat transportiert strukturelle Unter- einheiten und Virulenzfaktoren über die Barriere der inneren Membran nach aussen. Typ III Sekretionssysteme sind aus mehreren Untereinheiten aufgebaut, aber über die Funktion einzelner Untereinheiten und den molekularen Mechanismus des Proteintransports ist wenig bekannt.
Der erste Teil dieser Dissertation zeigt, dass Proteintransport durch das Typ III Sekretionssystems des Flagellums unter Zuhilfenahme des Membran-Protonengradienten ermöglicht wird und dass viele Untereinheiten des Transportssystems nicht für den eigentlichen Transportprozess nötig sind, sondern eine unterstützende Funktion inne haben. Proteintransport durch das Typ III Sekretionssystem wurde durch Zugabe eines Protonophors inhibiert. Deletionsmutanten der Flagellum-spezifischen ATPase FliI waren begrenzt zur Fortbewegung fähig und bildeten manchmal komplette Flagellen. Bislang wurde davon ausgegangen, dass die Hydrolyse von ATP die Energie für den Proteintransport bereitstellt. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch, dass der Protonengradient und nicht Hydrolyse von ATP für den Proteintransport durch das Typ III Sekretionssystem des Flagellums nötig ist.
Das Typ III Sekretionssystem des Flagellums benötigt sechs Membranproteine (FliO, FliP, FliQ, FliR, FlhA, FlhB), drei cytoplasmatische Proteine (FliH, FliI, FliJ) und einen cytoplasmatischen Ring (FliG, FliM, FliN) für effizienten Proteintransport. Wir führten eine positive Selektion für Mutanten durch, die in der Lage waren auch ohne den cytoplasmatischen Ring, den sogenannten C-Ring, ein Modelsubstrat in das Periplasma zu sekretieren. Wir fanden Mutationen, die in bekannter oder unbekannter Weise Einfluss auf die Genexpression des Flagellums haben. Alle Mutationen führten dazu, dass das Operon des Hauptregulator des Flagellums, flhDC, mindestens doppelt so stark exprimiert wurde. Die verstärkte Expression des Hauptregulators führte zur erhöhten Bildung von Basalkörpern des Flagellums. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass der cytoplasmatische C-Ring hauptsächlich als Drehkörper des Flagellums fungiert. Eine sekundäre, unterstützende Funktion des C-Rings wäre die Bereitstellung einer Affinitätsbindestelle für Exportsubstrate des Typ III Sekretionssystems.
In einem weiteren Schritt erfassten wir die Transportskapazitäten von einer Vielzahl von Mutanten des Typ III Sekretionssystems des Flagellums. Quantifizierbare Ergeb- nisse lieferte der Transport eines Modelsubstrates bestehend aus einer Fusion des flagellären FlgE-Proteins als Sekretionssignal und der β-Laktamase. Nur wenn dieses Fusionsprotein in das Periplasma transportiert wurde, waren die Bakterien gegen Ampicillin resistent. Mit dieser Methode konnten wir zeigen, dass die cytoplasmatischen Komponenten des Typ III Sekretionssystems, der C-Ring des Flagellums und das Membranprotein FliO nicht für den Proteintransport essentiell sind. Die Überexpression eines einzelnen Membranproteins des Typ III Sekretionssystems, FliP, ermöglichte signifikanten Transport des Modellsubstrates. Dies deutet darauf hin, dass FliP den zentralen Kanal des Transportsystems bildet. Diese Ergebnisse ermöglichen es uns eine Hypothese über die Organisation und Funktion des Typ III Sekretionssystems des Flagellums auf molekularer Ebene vorzuschlagen.
Ein flexibles Gelenkstück verbindet den Basalkörper des Flagellums mit dem starren Filament ausserhalb der Zelle. Dieses Gelenkstück ist nötig für eine effiziente Über
tragung der Rotationsenergie. Die Länge des Gelenkstücks wird in Salmonella enterica durch spezifische Mechanismen genau kontrolliert. Ein molekulares Maßband, das Protein FliK, misst die Länge des Gelenkstücks und überträgt diese Information an FlhB, welches Bestandteil des Typ III Sekretionssystems des Flagellums in der cytoplasmatischen Membran ist. Eine Interaktion zwischen dem Carboxy-Ende von FliK und FlhB induziert einen Wechsel in der Erkennungsspezifität des Typ III Sekretionssystems. Dieser Wechsel führt dazu, dass nicht mehr Komponenten des Basalkörpers, sondern sogenannte ’späte’ Substrate, wie zum Beispiel die Untereinheiten des Filaments, transportiert werden. In der Literatur wurden mehrere Modelle über den Mechanismus der Längenkontrolle des Gelenkstück vorgeschlagen, die allerdings nicht alle publizierten Sachverhalte befriedigend erklären können.
Im zweiten Teil dieser Dissertation zeigen wir, wie die Länge des flagellären Gelenkstücks durch das molekulare Maßband FliK festgelegt wird. FliK wird hierbei konstant, aber abwechselnd mit FlgE-Untereinheiten des Gelenks während dessen Aufbaus sekretiert und legt die Länge des Gelenkstücks durch einen statistischen Mechanismus fest. Unsere Ergebnisse widerlegen ein früheres Modell, wonach der C-Ring als Becher fungiert und ein Becher voller FlgE-Untereinheiten die Länge des Gelenkstücks festlegt. Wir überprüften dieses Model, indem wir die Länge des Gelenkstücks in einer Mutante untersuchten, die keinen C-Ring mehr produziert. Die Länge des Gelenkstücks des Flagellums in dieser Mutante war jedoch vergleichbar mit dem Wildtyp. Ein anderes Model besagte, dass FliK die Länge des Gelenkstücks im Cytosol reguliert, weil bestimmte Deletionsmutanten von FliK zwar zu einer Verringerung der Länge des Gelenks führten, aber anscheinend nicht nach aussen transportiert wurden. Wir konnten jedoch zeigen, dass diese Deletionsmutanten instabil waren, aber dennoch nach aussen sekretiert wurden. Indem wir die Biosynthese des Gelenks von der Expression von FliK abkoppelten, waren wir weiterhin in der Lage unser Modell eines unregelmässig sekretierten, molekularen Maßbands zu beweisen. In Abwesenheit von FliK wird die Biosynthese des Gelenkstücks weit über die physiologische Länge fortgesetzt. Wir konnten zeigen, dass jedoch in diesem Fall der erstmalige Export von FliK sofort den Wechsel in der Sekretionsspezifität auslöst. Dies ist konsistent mit unserem Modell, wonach die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Interaktion zwischen FliK und FlhB eine ansteigende Funktion der Länge des Gelenkes ist. Unsere Messungen der Gelenklänge zeigten weiterhin eine hervorragende Übereinstimmung mit einem mathematischen Modell des hier vorgeschlagenen Mechanismus, welcher ein unregelmässig sekretiertes, molekularen Maßband vorschlägt. Zum Schluss schlagen wir einen potentiellen, molekularen Mechanismus vor, der beschreibt wie FliK in der Lage ist die Länge des Gelenkstücks zu kontrollieren. Bei diesem Modell bestimmt die Geschwindigkeit mit der FliK sekretiert wird, ob es zu einer erfolgreichen Interaktion mit FlhB kommt. Wir zeigen in dieser Arbeit, dass die Geschwindigkeit der FliK Sekretion invers mit der Länge des Gelenkstücks korreliert.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Bacterial Flagellum, Salmonella enterica, Type III protein export, Transposon mutagenesis, Hook-length control, Molecular ruler
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690ERHARDT, Marc, 2011. Assembly of the Bacterial Flagellum : How Salmonella Exports Flagellar Proteins and Controls Hook Length [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Type III secretion systems are made of multiple proteins, however, the function of individual subunits and the molecular mechanism of protein translocation is poorly understood.&lt;br /&gt;The first part of this thesis reports that the flagellar type III secretion system functions as a proton-driven protein exporter and demonstrates that many components of the apparatus have a facilitating role and are dispensable for the actual protein translocation process. Treatment with a protonophore that disrupts the membrane proton gradient of the cell prevented export of flagellar substrates. In a mutant strain deleted for the flagellar-specific ATPase FliI, we observed weak swarming motility and rare formation of flagella. Hydrolysis of ATP had been considered to provide energy for protein translocation via the flagellar type III export apparatus but these findings demonstrate that flagellar secretion in Salmonella enterica requires the proton motive force while ATP hydrolysis is not essential.&lt;br /&gt;For efficient export function of the flagellar type III secretion system, six integral membrane proteins (FliOPQR FlhAB), three soluble proteins (FliHIJ) and the rotor- switch complex (FliGMN) are needed. We sought mutants that allowed for export of a model substrate into the periplasm in the absence of the rotor-switch complex, the C-ring. We isolated mutants in known and unknown flagellar regulatory loci that resulted in at least two-fold increased expression of the flagellar master operon, flhDC. The increased flhDC expression coincided with elevated levels of hook-basal-body formation. These results indicate that the C-ring functions primarily as the rotor of the flagellum and provides a secondary, facilitating role during type III secretion as a affinity cup-like structure that enhances the specificity and efficiency of the export process.&lt;br /&gt;We next measured export of a flagellar-specific model substrate in a battery of export-apparatus mutants. Export of a hook-β-lactamase fusion protein into the periplasm confers quantifiable ampicillin resistance. We found that the soluble components of the flagellar type III secretion system, the cytoplasmic C-ring and the membrane protein FliO are dispensable for export. Overexpression of a single membrane protein, FliP, resulted in significant export of the reporter substrate, indicating that FliP forms the central channel of the secretion apparatus. Finally, we present the first molecular-level hypothesis for the organization and mechanism of the flagellar type III secretion system.&lt;br /&gt;For efficient transmission of rotational energy from the flagellar basal-body to the rigid, extracellular filament, a flexible coupling structure is needed. The length of this flexible joint, the hook, is tightly controlled in Salmonella enterica by an intrinsic control mechanism. A molecular ruler, FliK, measures the length of the hook and transmits this information back to the FlhB component of the secretion apparatus at the base of the flagellum. Here, an interaction between the carboxy-terminus of FliK and FlhB induces a specificity switch in the flagellar type III secretion apparatus from secretion of rod- hook-type substrates to secretion of late substrates, including the filament subunits. 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April 7, 2011
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