Functional Analysis of Mutants in the Transmembrane Region-1 and Octarepeat Region of Prion Protein

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2007
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Malaisé, Muriel
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Funktionale Analyse von Mutanten in der Transmembranregion-1 und in der Octarepeat-Region des Prion-Proteins
Publikationstyp
Dissertation
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Zusammenfassung

The cellular prion protein (PrPPcP) is a glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI)-anchored 35 kDa glycoprotein located on the outer surface of the plasma membrane and plays an essential role in the pathogenesis of several inherited and transmissible neurodegenerative diseases such as Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome (GSSS). Despite being the subject of many recent studies, the physiological function of PrPPcP remains largely unresolved. Several candidate functions have been discussed, including binding and internalisation of copper or other metals, superoxide dismutase-like activity, signal transduction and regulation of cellular antioxidant activities. The transmembrane (TM1) region of PrPPcP (codons 110-135) should play a key role in PrPPcP function because of its high conservation throughout evolution. Moreover it contains an array of hydrophobic amino acids, and peptides derived from this region are neurotoxic.
The aim of the present study was to try to elucidate a possible role of PrPPcP in the regulation mitochondrial membrane potential (), in the regulation of the basal level of endogenous reactive oxygen species (ROS) and in antioxidative defence. For this purpose transiently transfected mouse neuroblastoma cells overexpressing PrP, either as wild-type (wt) protein or as a deletion mutant lacking codons 114-121 (henceforth called Δ8TM1-PrP), were analysed. In addition a deletion mutant in the octarepeat region (octa-PrP) was studied. The results showed that wt-PrP and 8TM1-PrP have no impact on . Likewise, overexpression of PrP (wt or mutant) had no impact on endogenous ROS levels. However, under conditions of oxidative stress induced by H2O2 treatment of the cells, ROS levels were lower in cells transfected with wt-PrP or Δ8TM1-PrP expression plasmids.
Increased phosphorylation of ERK2 (p42) and decreased phosphorylation of JNK1/JNK2/3 seemed to be linked to this protective effect of PrPc.
Two other systems derived from transgenic Δ8TM1-PrP mouse brain (whole-brain or cerebellar granular neurones [CGN]) were also studied, but no biological impact of the transgene 8TM1-PrP was observable, most likely due to the low expression level.
In conclusion, the protective effect of PrPPcP against oxidative stress implicates its octarepeat region but not its TM1 domain; it does not manifest as lowered basal ROS level; and it seems to involve the MAPK pathway, especially p42 and JNK1/JNK2/3.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Das zelluläre Prion-Protein (PrPPcP) ist ein Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol-verankertes Protein von 35 kDa, welches an der Außenseite der Plasmamembran lokalisiert ist. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese verschiedener erblicher bzw. infektiös übertragbarer neurodegenerativer Erkrankungen, wie der Creutzfeldt-Jakob Krankheit (CJD) und des Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndroms (GSSS). Obwohl PrPPcP Gegenstand zahlreicher aktueller Forschungsarbeiten ist, bleibt seine physiologische Funktion unklar. Einige vermutete Funktionen sind bereits untersucht worden, so z.B. die Bindung und Aufnahme von Kupfer oder anderer Metalle, eine Superoxiddismutase-ähnliche Aktivität, Signalübertragung sowie die Regulation der zellulären Antioxidantienaktivität. Aufgrund ihrer hohen evolutionären Konservierung sollte die Transmembranregion (TM1) von PrP (Codons 110-135) eine Schlüsselrolle spielen. Zudem umfasst diese Region zahlreiche hydrophobe Aminosäuren, und von dieser Region abgeleitete Peptide sind neurotoxisch.
Das Ziel vorliegender Arbeit war, eine mögliche Rolle von PrPPcP bei der Regulation des mitochondrialen Membranpotentials (), des Basalspiegels von endogenen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und bei der antioxidativen Abwehr zu charakterisieren. Um die physiologische Rolle der TM1-Domäne des PrPc näher zu untersuchen, wurde eine Deletionsmutante mit Verlust der Codons 114-121 (Δ8TM1-PrP) sowie zusätzlich eine Mutante mit Deletion der Octarepeat -Region [octa-PrP]) sowie als Kontrolle wildtypisches PrP verwendet. Diese PrP-Versionen wurden in transient transfizierten Maus-Neuroblastomzellen überexprimiert. Die Ergebnisse zeigten, dass wt-PrP und 8TM1-PrP haben keinen Einfluss auf  haben. Ebenso hatte die Überexpression von PrP (als wildtypische oder mutierte Version) keinen Einfluss auf den Spiegel von endogenen ROS. Es konnte hingegen klar gezeigt werden, dass unter Bedingungen von oxidativem Stress der intrazelluläre ROS-Spiegel in Zellen, die mit wt-PrP oder Δ8TM1-PrP transfiziert waren, signifikant abgesenkt war.
Dieser Schutzeffekt von PrPc scheint mit einer verstärkten Phosphorylierung von ERK2 (p42) und ein verminderten Phosphorylierung von JNK1/JNK2/3 in Verbindung zu stehen.
Außerdem wurden zwei weitere experimentelle Systeme, nämlich Primärzellkulturen aus dem Gehirn von transgenen Δ8TM1-PrP-Mäusen (gemischte Kulturen aus dem Gesamthirn bzw. zerebelläre granuläre Neuronen) untersucht. Es konnte jedoch keine biologische Auswirkung des Transgens festgestellt werden, vermutlich wegen des sehr niedrigen Expressionsniveaus.
Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wird gefolgert, (1) dass der Schutzeffekt des PrPc gegen oxidativen Stress durch die Octarepeat -Region, nicht jedoch durch die TM1-Domäne vermittelt wird; (2) dass der besagte Schutzeffekt sich nicht in einem niedrigeren basalen ROS-Niveau manifestiert; und (3) dass der MAPK-Pfad, insbesondere p42 und JNK1/JNK2/3, beteiligt zu sein scheint.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Transmembranregion-1, Antioxidantienaktivität, ROS, mitochondriales Membranpotential, Prion protein, TM-1 region, copper, antioxidant, mitochondrial membrane potential
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ISO 690MALAISÉ, Muriel, 2007. Functional Analysis of Mutants in the Transmembrane Region-1 and Octarepeat Region of Prion Protein [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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