Artifizielle G-Quadruplexe und Identifizierung von neuen G-Quadruplexliganden

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2011
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Artificial Q-quadruplexes and identification of novel G-quadruplex ligands
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Dissertation
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Abstract
G-Quadruplexe sind in vielerlei Hinsicht äußerst interessante Nukleinsäurestrukturen: Auf molekularer Ebene zeigen sie eine faszinierende Anzahl polymorpher Formen, die für innovative nanotechnologische Anwendungen verwendet werden können. Zudem sind genomische G-Quadruplexe an einer Vielzahl biologischer Prozesse, wie der Regulation von Transkription und Translation sowie der Stabilität der Telomere beteiligt. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse daran, hochaffine und spezifische Liganden für G-Quadruplexe zu identifizieren, um diese für therapeutische Zwecke zu nutzen. G-Quadruplexliganden für die humane Telomersequenz können zum Beispiel die Proliferation von Krebszellen hemmen und sind damit als potentielle Anti-Tumor Agenzien interessant.
Das Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum besseren Verständnis hinsichtlich der Faltung und Stabilität von G-Quadruplexen durch Vergleichsstudien von DNA- mit RNA-Sequenzen zu leisten. Zusätzlich sollten durch den Austausch der natürlichen Guanosin-Grundbausteine gegen Guanosinderivate die Struktur des humanen Telomerquadruplexes programmiert und weitere artifizielle Strukturen erzeugt werden. Abschließend sollten über eine Hochdurchsatz-Durchmusterung neue Klassen von G-Quadruplexliganden aus einer Bibliothek mit niedermolekularen Substanzen identifiziert werden.
In der vorliegenden Dissertation wurde eine Vielzahl an DNA- bzw. RNA-G-Quadruplexstrukturen hinsichtlich ihrer Topologie und Stabilität miteinander verglichen. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf bekannten DNA-Sequenzen, deren jeweilige RNA-Sequenzen mittels CD-Spektroskopie und CD-Schmelzpunktanalysen untersucht wurden. Im Gegensatz zu den DNA-Sequenzen, welche G-Quadruplexe in unterschiedlichen Topologien ausbilden, falten die RNA-Sequenzen ausschließlich in parallele Strukturen, welche meist eine höhere Stabilität als die entsprechenden DNA-Strukturen aufweisen. Vor allem die thermodynamisch weniger stabilen Sequenzen zeigen eine starke Kaliumionenabhängigkeit, wobei die RNA-Quadruplexe wesentlich stärker als die zugehörigen DNAs stabilisiert werden. Diese Tatsache weist darauf hin, dass die Faltung von G-Quadruplexen an entscheidenden Positionen in mRNAs die Genexpression stärker als bisher vermutet beeinflussen könnte.
Weiterhin wurde die Struktur des humanen Telomerquadruplexes (HT-Quadruplex) erstmalig zu einer ausschließlich parallelen bzw. antiparallelen Topologie hin programmiert. Durch gezielten Einbau der Guanosinderivate 8-Oxoguanosin und Xanthosin in die HT-Quadruplexsequenz wird die Ausbildung einer konstruktiven Tetrade mit unverändert vier Wasserstoffbrückenbindungen ermöglicht. Die programmierten Strukturen zeigen im Vergleich zum unmodifizierten G-Quadruplex nur eine unwesentlich geringere Stabilität und könnten somit für die Entwicklung von strukturspezifischen Antikörpern oder niedermolekularen G-Quadruplexliganden dienen.
Analog zum Vorgehen bei dem humanen Telomerquadruplex wurde auch die Sequenz eines parallelen G-Quadruplexes modifiziert und die Auswirkungen auf Faltung und Stabilität der Struktur untersucht. Zusätzlich zu einer Tetrade bestehend aus 8-Oxoguanosin und Xanthosin wurde eine Tetrade ausschließlich mit 8-Oxoguanosin konstruiert. Es konnte gezeigt werden, dass dieser artifizielle G-Quadruplex ohne monovalente Kationen eine stabilere Struktur als die unmodifizierte Sequenz bildet.
In einem weiteren Teilprojekt der vorliegenden Dissertation sollten neue G-Quadruplexligandklassen mittels Durchmusterung einer Bibliothek niedermolekularer Substanzen identifiziert werden. Hierfür wurde ein Hochdurchsatz-geeignetes Verfahren basierend auf FRET-Messungen mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode wurden aus 34.000 Substanzen drei Liganden des humanen Telomerquadruplexes identifiziert. Neben Berberin, einem bereits bekannten antiproliferativen Wirkstoff, wurden ein chinolinbasierter Zyaninfarbstoff und Carbamid identifiziert. Während alle drei identifizierten Liganden mit EC50-Werten im niederen mikromolaren Bereich sehr hohe Affinitäten zeigen, zeichnen sich Berberin und der Zyaninfarbstoff zusätzlich durch eine hohe Selektivität gegenüber doppelstränger DNA und vergleichbaren Affinitäten aus. Alle drei Liganden können somit als Leitstrukturen für die Entwicklung potenter und spezifischer therapeutischer Wirkstoffe dienen.
Summary in another language
G-quadruplexes are in many respects very interesting nucleic acid structures: At the molecular level they show a fascinating number of polymorphic forms that can be used for innovative nanotechnology applications. In addition, genomic G-quadruplexes are involved in a variety of biological processes such as regulation of transcription or translation and the stabilization of telomeres. For this reason, there is great interest to identify high-affinity and specific ligands for G-quadruplexes in order to use them for therapeutic purposes.
For example G-quadruplex ligands for the human telomeric sequence could inhibit the proliferation of cancer cells and are thus of interest as potential anti-tumor agents. The aim of this study was to contribute to a better understanding regarding the folding and stability of G-quadruplexes through comparative studies of DNA and RNA sequences. In addition, replacement of natural guanosine building blocks by guanosine derivatives should enable programming of the human telomeric quadruplex and creation of other artificial structures. Finally, new classes of G-quadruplex ligands should be identified via a high-throughput screening of a small molecule library.
In this work a variety of DNA and RNA G-quadruplex structures were compared in terms of topology and stability. The main focus was on known DNA sequences and the respective RNAs were analyzed by CD spectroscopy and CD melting point measurements. In contrast to the DNA sequences that form G-quadruplexes in different topologies, the RNA sequences fold only in parallel structures, which generally show higher stabilities than the corresponding DNA structures. In particular, the thermodynamically less stable sequences show a strong dependence for potassium ions, whereas the RNA quadruplexes are stabilized significantly stronger than the corresponding DNAs. This fact indicates that the folding of G-quadruplexes in key positions in the mRNA could affect gene expression more than previously suspected.
Furthermore, the structure of human telomeric quadruplex (HT quadruplex) was programmed for the first time exclusively to a parallel or anti-parallel topology. This was possible by specific insertion of the guanosine derivatives 8-oxoguanosine and xanthosine into the HT sequence. The programmed structures show only a marginally lower stability than the unmodified G-quadruplex and could therefore be used for the development of structure-specific antibodies or low molecular weight G-quadruplex ligands.
Analogous to the approach for the human telomeric G-quadruplex also the sequence of a parallel G-quadruplex was modified and the effects on folding and stability of the structure were studied. In addition to tetrads consisting of 8-oxoguanosine and xanthosine a tetrad with only 8-oxoguanosine was constructed. It was shown that this artificial G-quadruplex forms even without monovalent cations a more stable structure than the unmodified sequence.
Another project of this dissertation was the identification of novel G-quadruplex ligand classes by screening a library of low molecular weight substances. For this purpose a high-throughput suitable method based on FRET measurements using fluorescently labeled oligonucleotides was developed. Using this method three ligands of the human telomeric G-quadruplex were identified from 34.000 substances. In addition to berberine, a known anti-proliferative agent, a chinoline based cyanine dye and carbamide were identified. While all three identified ligands show very high affinities with EC50 values in the low micromolar range, berberine and the cyanine dye also show high selectivity for quadruplex structures in comparison to double stranded DNA. Thus all three ligands may serve as lead structures for the development of potent and specific therapeutic agents.
Subject (DDC)
540 Chemistry
Keywords
G-Quadruplexliganden,G-Quadruplex ligands
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Cite This
ISO 690BENZ, Armin, 2011. Artifizielle G-Quadruplexe und Identifizierung von neuen G-Quadruplexliganden [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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January 21, 2011
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