Molecular Characteristics of Kidney Cancer

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2008
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Molekulare Grundlagen der Nierenkanzerogenese
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Dissertation
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Zusammenfassung

Einleitung:Krebserkrankungen wie etwa Nierenkrebs werden häufig durch Fremdstoffe verursacht. Zur Bestimmung des kanzerogenen Potentials dieser Fremdstoffe sind 2-jährige Kanzerogenesestudien in Nagetieren vom Gesetzgeber vorgeschrieben. Derartige Studien sind jedoch zeitaufwendig und teuer, verursachen einen hohen Tierverbrauch und setzen einen hohen Bedarf an Testsubstanzen voraus. Hinzu kommt, dass die Ergebnisse dieser Langzeit-Studien oft durch unspezifische Hochdosiseffekte, eine altersabhängige Pathologie oder durch nagetierspezifische Effekte verfälscht werden. Umgekehrt vernachlässigen sie den Einfluss zusätzlicher Krebsrisikofaktoren beim Menschen, etwa eine fetthaltige Diät und Fettleibigkeit. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, ob Nieren-kanzerogene Substanzen bereits in Kurzeit-In-Vivo-Studien durch Microarray-Transkriptomanalysen identifiziert werden können. Des weiteren sollten molekulare Mechanismen bei der Entwicklung von Fremdstoff-induzierten Nierentumoren charakterisiert werden. Schließlich sollten die Einflüsse einer fettreichen Diät sowie erhöhter Fettleibigkeit auf die Nierenkanzerogenese in der Ratte bestimmt werden. Experimenteller Aufbau: I) TSC2(+/+) Wildtyp- sowie TSC2(+/-) Eker Ratten wurden täglich mit den genotoxischen Nierenkanzerogenen Aristolochia Säure (AA), Methylazoxymethanol Azetat (MAMAc), oder dem nicht-genotoxischen Nierenkanzerogen Ochratoxin A (OTA) gavagiert. Nach 1, 3, 7 und 14 Tagen wurden von Nierenkortex-Homogenaten aller behandelten und Kontroll-Tiere Genexpressionsprofile mittels Microarrays erstellt. Paraffinschnitte wurden zur Untersuchung von Histopathologie und Zellproliferation verwendet. II) Eker Ratten wurden mit AA, MAMAc und OTA über 3 und 6 Monate gavagiert und histopathologische Veränderungen und Zellproliferationsraten bestimmt. Parallel hierzu wurde ein Protokoll entwickelt, welches erstmals reproduzierbare und verlässliche Genexpressionsanalysen von mikrodissektierten Nierentubuli ermöglichte. Nach diesem Protokoll wurden Transkriptionsanalysen aus Präneoplasien sowie aus gesunden Nierentubuli AA-, OTA- und Vehikel-behandelter Eker Ratten erstellt. Die zentralen Ergebnisse dieser Genexpressionsanalysen wurden mittels immunhistochemischen Färbungen verifiziert. III) Adverse Effekte auf Nierenpathologie und zelluläre Signalwege wurden in zwei Subpopulationen von Wistar-Ratten mit hoher Sensitivitaet bzw. Resistenz gegenüber nahrungsinduzierter Adipositas nach 11-monatiger Exposition mit fetthaltiger Diät, sowie in Wistar-Ratten nach Exposition mit fettarmer Diät untersucht. Ergebnisse/Diskussion: Histopatholgische Untersuchungen sowie Genexpressionsanalysen aus Nierenkortexhomogenaten zeigten, dass früheste substanzspezifische Effekte Nieren-kanzerogener Substanzen bereits nach 1 bis 14-tägiger Exposition mit AA, MAMAc bzw. OTA erkennbar sind. Besagte Genexpressionsprofile erlaubten die Unterscheidung von genotoxischen und nicht-genotoxischen Substanzen und erwiesen sich als prediktiv für die substanzspezifische Inzidenz und Zahl von präneoplastischen Läsionen in Eker Ratten nach 3- bzw. 6-monatiger Exposition. Genexpressionsprofile aus mikrodissektierten präneoplastischen Läsionen von Eker Ratten nach 6-monatiger Exposition mit AA, OTA oder dem Vehikel zeigten im Vergleich zu mikrodissektierten gesunden Tubuli von Vehikel-behandelten Ratten eine stark erhöhte Deregulation gleicher Gene. Des weiteren konnten nur geringfügige Genexpressionveränderungen in gesunden Tubuli von AA- und OTA-behandelten Ratten gemessen werden. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Anzahl der präneoplastischen Läsionen, die während einer begrenzten kritischen Phase der Substanzbehandlung entstehen, ausschlaggebend für die Inzidenz und Anzahl von Tumoren am Ende der 2-jährigen Kanzerogenese Studie sein könnte. Die klonale Expansion dieser Läsionen ist demgegenüber eher ein substanzunabhängiger Prozess, der möglicherweise durch eine Deregulation des mTOR Signalwegs verstärkt wird. Im letzten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine stark fetthaltige Diät eine deutlich schädliche Wirkung auf Rattennieren ausübt. Der Grad der Adipositas nahm im Vergleich zu den adversen Effekten der über die Nahrung aufgenommenen Lipide nur eine untergeordnete Rolle ein. Immunohistochemische Färbungen der Nieren wiesen zudem auf eine Rolle des mTOR Signalweges bei der Lipid-induzierten Pathologie der Niere. Fazit: Microarrays erlauben die Charakterisierung von frühesten molekularen Vorgängen bei der Entstehung von Fremdstoff-induzierten Nierentumoren in Kurzzeit-In-Vivo-Studien. Dabei erfüllen sie wichtigen Vorraussetzungen für eine verlässliche Identifizierung von Nieren-kanzerogenenen Substanzen, nämlich eine hohe Sensitivität, Spezifität und Prediktivität. Langfristig könnte somit unter Verwendung neuer und sensitiver Detektionstechniken 2-jährige Kanzerogenesestudien deutlich verkürzt werden, was auch eine Reduzierung des Tierverbrauchs ermöglichen würde.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Background: The vast majority of all human cancers, including kidney cancer, are caused by xenobiotica. Two-year rodent bioassays play the central role in evaluating the carcinogenicity of chemicals and are mainly based on a post-mortem evaluation of tumor incidences and other pathological changes after two years of exposure. However, such lifetime bioassays are time-consuming and costly, require large numbers of animals and a high amount of compound for continuous dosing over the entire period of the assay. In addition, widespread age-related pathologies, unspecific high-dose effects, or rodent-specific carcinogenic effects with little or no relevance to humans can confound the outcome of these studies. Furthermore, they do not account for possible additive effects of other cancer risk factors, such as diet-induced obesity. Therefore, interest in developing short, sensitive but robust, and mechanistically based in vivo studies has grown, allowing a more reliable human risk assessment. The overall aim of this thesis was to elucidate whether short-term in vivo assays in combination with microarray technology can be used to identify renal carcinogens. In addition, a more detailed understanding of potential additive effects of high fat diet exposure, and molecular mechanisms underlying chemically induced renal carcinogenesis, should be obtained. Experimental Setup: I) TSC2-mutant Eker and wild type rats were gavaged daily with the genotoxic renal carcinogens aristolochic acid (AA) and methylazoxymethanol acetate (MAMAc), or with the non-genotoxic ochratoxin A (OTA), respectively. Subsequent 1, 3, 7 and 14 days of exposure, gene-expression profiles from kidney cortex homogenates, histopathology, and cell proliferation were assessed. II) Eker rats were gavaged with AA, MAMAc and OTA for 3 or 6 months. Subsequently, renal histopathology and cell proliferation were evaluated. In addition, a novel protocol for reproducible and reliable gene expression analysis from laser-microdissected pre-neoplastic renal lesions was established, and gene expression profiles of different stages of preneoplastic lesions and healthy tubules were examined from 6 months AA-, OTA- and vehicle-treated male Eker rats. Key findings from transcriptome analyses were verified by immunohistochemistry. III) The respective impacts of dietary lipids and high body adiposity on renal pathology and pathways involved in renal cancer were delineated in diet-induced obesity-sensitive and diet-induced obesity-resistant subpopulations of male Wistar rats vs. chow-fed controls, subsequent to 11 months of high fat diet or standard chow exposure, respectively. Results/Discussion: Renal histopathology and gene expression profiling of kidney homogenates of short-term AA-, MAMAc-, and OTA-treated rats revealed that microarray technology is a sensitive tool to study earliest events of renal carcinogenesis. In addition, gene expression profiles allowed dissecting genotoxic from non-genotoxic modes of action. Most importantly, early gene expression changes after short-term exposure were predictive for the incidence and number of preneoplastic lesions after 3 or 6 months of exposure. Gene expression profiles from microdissected preneoplastic lesions of 6-month AA-, OTA- or control rats revealed marked gene deregulations, when compared to healthy tissue of control animals. Notably, gene expression changes were similar in different lesion progression stages and after treatment with genotoxic or non-genotoxic carcinogens. Furthermore, gene expression profiles of microdissected healthy tubules of AA- and OTA-treated rats were only marginally changed, suggesting a low compound-sensitivity. These findings suggested that the number of preneoplastic lesions initially formed during a critical period of exposure may primarily drive the incidence and number of solid tumors. In contrast, clonal expansion of these lesions may be compound-independent and instead be driven by a disturbed feedback inhibition of the mTOR pathway. Last, high fat diet exposure of male Wistar rats revealed a clear adverse effect of dietary lipids, and a minor role of the degree of body adiposity, on renal morphology. In addition, immunohistochemical analyses suggested a major role of the mTOR pathway in dietary lipid-induced pre-neoplastic pathology. Conclusion: Microarray-based short-term in vivo assays not only help to delineate molecular events important for renal cancer, but also fulfill the most important prerequisites for reliable carcinogenicity testing, i.e. high sensitivity, high specificity, and high predictivity. Thus, the duration of the standard two-year rodent bioassay can be reduced to a shorter period of time by using novel and sensitive methodology such as microarrays. Ultimately, this thesis provides encouraging first results that may help to reduce, refine and one day even replace animal experiments.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Kidney, tumor, microarray
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690STEMMER, Kerstin, 2008. Molecular Characteristics of Kidney Cancer [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Des weiteren sollten molekulare Mechanismen bei der Entwicklung von Fremdstoff-induzierten Nierentumoren charakterisiert werden. Schließlich sollten die Einflüsse einer fettreichen Diät sowie erhöhter Fettleibigkeit auf die Nierenkanzerogenese in der Ratte bestimmt werden. Experimenteller Aufbau: I) TSC2(+/+) Wildtyp- sowie TSC2(+/-) Eker Ratten wurden täglich mit den genotoxischen Nierenkanzerogenen Aristolochia Säure (AA), Methylazoxymethanol Azetat (MAMAc), oder dem nicht-genotoxischen Nierenkanzerogen Ochratoxin A (OTA) gavagiert. Nach 1, 3, 7 und 14 Tagen wurden von Nierenkortex-Homogenaten aller behandelten und Kontroll-Tiere Genexpressionsprofile mittels Microarrays erstellt. Paraffinschnitte wurden zur Untersuchung von Histopathologie und Zellproliferation verwendet. II) Eker Ratten wurden mit AA, MAMAc und OTA über 3 und 6 Monate gavagiert und histopathologische Veränderungen und Zellproliferationsraten bestimmt. Parallel hierzu wurde ein Protokoll entwickelt, welches erstmals reproduzierbare und verlässliche Genexpressionsanalysen von mikrodissektierten Nierentubuli ermöglichte. Nach diesem Protokoll wurden Transkriptionsanalysen aus Präneoplasien sowie aus gesunden Nierentubuli AA-, OTA- und Vehikel-behandelter Eker Ratten erstellt. Die zentralen Ergebnisse dieser Genexpressionsanalysen wurden mittels immunhistochemischen Färbungen verifiziert. III) Adverse Effekte auf Nierenpathologie und zelluläre Signalwege wurden in zwei Subpopulationen von Wistar-Ratten mit hoher Sensitivitaet bzw. Resistenz gegenüber nahrungsinduzierter Adipositas nach 11-monatiger Exposition mit fetthaltiger Diät, sowie in Wistar-Ratten nach Exposition mit fettarmer Diät untersucht. Ergebnisse/Diskussion: Histopatholgische Untersuchungen sowie Genexpressionsanalysen aus Nierenkortexhomogenaten zeigten, dass früheste substanzspezifische Effekte Nieren-kanzerogener Substanzen bereits nach 1 bis 14-tägiger Exposition mit AA, MAMAc bzw. OTA erkennbar sind. Besagte Genexpressionsprofile erlaubten die Unterscheidung von genotoxischen und nicht-genotoxischen Substanzen und erwiesen sich als prediktiv für die substanzspezifische Inzidenz und Zahl von präneoplastischen Läsionen in Eker Ratten nach 3- bzw. 6-monatiger Exposition. Genexpressionsprofile aus mikrodissektierten präneoplastischen Läsionen von Eker Ratten nach 6-monatiger Exposition mit AA, OTA oder dem Vehikel zeigten im Vergleich zu mikrodissektierten gesunden Tubuli von Vehikel-behandelten Ratten eine stark erhöhte Deregulation gleicher Gene. Des weiteren konnten nur geringfügige Genexpressionveränderungen in gesunden Tubuli von AA- und OTA-behandelten Ratten gemessen werden. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Anzahl der präneoplastischen Läsionen, die während einer begrenzten kritischen Phase der Substanzbehandlung entstehen, ausschlaggebend für die Inzidenz und Anzahl von Tumoren am Ende der 2-jährigen Kanzerogenese Studie sein könnte. Die klonale Expansion dieser Läsionen ist demgegenüber eher ein substanzunabhängiger Prozess, der möglicherweise durch eine Deregulation des mTOR Signalwegs verstärkt wird. Im letzten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine stark fetthaltige Diät eine deutlich schädliche Wirkung auf Rattennieren ausübt. Der Grad der Adipositas nahm im Vergleich zu den adversen Effekten der über die Nahrung aufgenommenen Lipide nur eine untergeordnete Rolle ein. Immunohistochemische Färbungen der Nieren wiesen zudem auf eine Rolle des mTOR Signalweges bei der Lipid-induzierten Pathologie der Niere. 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December 15, 2008
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