Functional analysis of a heat shock inducible methyltransferase from Escherichia coli

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2005
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Hager, Jutta
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Funktionelle Analyse einer hitzeschock-induzierbaren Methyltransferase von Escherichia coli
Forschungsvorhaben
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Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
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Zusammenfassung

RrmJ wurde in einer umfassenden Studie von Richmond et al. als ein sehr hitzeinduzierbares E. coli Gen endeckt. In vorrausgegangenen Studien von uns und anderen wurde gezeigt, dass RrmJ als 2 -O-Methyltransferase das universell konservierte Nukleotid U2552 im A-loop der 23S rRNA methyliert. Deletion des rrmJ Genes zeigte, dass ein Stamm, der kein RrmJ expremiert, grosse Wachstumsschwierigkeiten und einen signifikanten Ribosomendefekt aufweist. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass die Um2552 Methylierung Einfluss auf die Assemblierung oder Stabilität des Ribosomes hat. Strukturelle Vergleiche von RrmJ mit anderen 2 -O-Methyltransferasen zeigte, dass vorallem VP39, ein bifunktionales Protein in Vaccinia virus, erstaunliche strukturelle Ähnlichkeiten aufwies. Da VP39 in der Vergangenheit sehr eingehend untersucht wurde, war diese strukturelle Ähnlichkeit von grossem Vorteil für die funktionelle Charackterisierung von RrmJ, welche in dieser Arbeit vorgestellt wird.
Mit Hilfe einer umfassenden Mutagenese Studie konnte ich das katalytische Zentrum sowie die Substratbindestelle von RrmJ untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das katalytische Zentrum aus der Triade KDK besteht. Dies erlaubte uns, einen SN2 Mechanismus für die Methylierungsreaktion zu postulieren. Die Aminosäuren, die ich als wichtig für die Substratbindung identifizieren konnte, bilden eine positiv geladene Kante, die mit dem Ribose-Rückgrad des RNA Substrates interagieren kann. Modellierungsstudien, durchgeführt in Kollaboration mit Bart Staker, wiesen darauf hin, dass der A-loop aus der eng gepackten 50S Struktur herausklappen muss, um von RrmJ methyliert werden zu können. Modellierungsstudien mit dem A-loop bestätigten ausserdem die zuvor postulierte Substratbindestelle und gaben zu erkennen, dass U2552 sich einem base flipping Mechanismus unterziehen muss, um in das katalytische Zentrum von RrmJ zu passen.
Co-Fraktionierungsstudien mit RrmJ bildeten die Grundlage für die wichtige Entdeckung, dass RrmJ als Assemblierungshelferprotein eine Methyltransferase-unabhängige Funktion ausübt. Der N-terminus von RrmJ erwies sich dabei als absolut notwendig für die Bindung von RrmJ an die 50S ribosomale Untereinheit. Ich konnte zeigen, dass die Bindung von RrmJ an die 50S ribosomale Untereinheit die Assemblierung des 70S Ribosomes unterstüzt. Desweiteren zeigte Caroline Kumsta, eine Diplomandin in unserem Labor, dass RrmJ einen Kälte-sensitiven Phänotypen aufweist, der characteristisch für Assemblierungshelferproteine ist. Diese zweite Funktion von RrmJ scheint daher verantwortlich für den Ribosomendefekt in der rrmJ Deletionsmutante zu sein, anstelle der Um2552 Methylierung, wie anfänglich irrtümlicherweise angenommen. Diese Schlussfolgerung wurde unterstüzt von Caroline Kumsta, die zeigen konnte, dass die Abwesenheit von U2552 keinen Ribosomendefekt verursacht.
Und schliesslich führte die Analyse der N-terminalen verkürzten RrmJ Mutante zu der Annahme, dass RrmJ ein zweites Methylierungsziel haben könnte, welches nicht die Bindung an die 50S ribosomale Untereinheit verlangt. Da eines der drei RrmJ Homologen in Hefe tRNA anstelle von rRNA methyliert und da in früheren Studien auch schon gezeigt wurde, dass RrmJ tRNA als Methylierungsziel erkennen kann, ist tRNA ein möglicher Kandidat. Desweiteren liess das Ribosomenprofil der rrmJ Deletionsmutante, die unter Hitzestress Bedingungen gewachsen war, darauf schliessen, dass RrmJ unter diesen Bedingungen nicht in die Ribosomenassemblierung invovliert ist. Daher ist es anzunehemn, dass die Methylierung des vermeintlichen zweiten Substrates RrmJ s Hitzestress Funktion sein könnte.
Mit der Beobachtung, dass RrmJ als Methyltransferase mit dualer Substratspezifität und als ribosomales Assemblierungshelferprotein unabhängig von der Methyltransferaseaktivität agiert, war es nun möglich, die vielen verschiedene Phänotypen und Effekte zu erklären, die durch die Deletion dieses hoch konservierten Proteins in einem E. coli Stamm verursacht werden.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

RrmJ was originally discovered by Richmond and coworkers as a highly heat inducible E. coli gene. Previous studies by us and others have shown that RrmJ functions as a 2 -O-methyltransferase that methylates the universally conserved uridine 2552 in the A-loop of the 23S rRNA. Deletion studies revealed that a strain lacking RrmJ shows a severely impaired growth as well as a strong ribosomal defect. This led to the conclusion that the U2552 methylation is involved in either ribosome assembly or stability. Structural comparison of RrmJ with other 2 -O-methyltransferases revealed striking similarities with the bi-functional protein VP39 from Vacchinia virus. Because VP39 has been intensively investigated in the past this structural resemblance was extremely helpful for the functional characterization of RrmJ as it is presented in this work.
Using extensive site directed mutagenesis I investigated the active site as well as substrate binding site of RrmJ. Our results revealed that RrmJ s active site is composed of a catalytic triad KDK, allowing us to propose a SN2 reaction mechanism for the methylation reaction. The amino acids that I have identified to be involved in substrate binding were found to build a positively charged ridge, which should be able to interact with the sugar phosphate backbone of the RNA substrate. Modeling studies performed in collaboration with Bart Staker suggested that the A-loop has to loop out of the tightly packed structure of the 50S ribosomal subunit in order to be accessible for RrmJ. Furthermore, modeling of the A-loop onto the surface of RrmJ underlined the proposed substrate binding site and suggested a base flipping mechanism for U2552 in order to fit into the active site of RrmJ.
Co-fractionation studies of RrmJ built the foundation for the major observation that RrmJ has a methyltransferase independent function as a ribosome assembly helper protein. For the binding of RrmJ to 50S ribosomal subunits, the N-terminus of RrmJ appeared to be crucial. I showed that the binding of RrmJ to the 50S ribosomal subunits supports the assembly process of the 70S ribosome. Furthermore, Caroline Kumsta, a Diploma student in our lab, showed that RrmJ exerts a cold sensitive phenotype as it is characteristic for ribosome assembly helper proteins. This second function of RrmJ appears to be responsible for the ribosomal defect observed in the rrmJ deletion strain, which has been previously falsely assigned to the Um2552 modification. This finding was supported by Caroline Kumsta, who showed that absence of U2552 does not lead to a ribosome assembly defect.
Lastly, analyzing the effects of the N-terminal truncated mutant of RrmJ revealed that RrmJ might have a second methylation target, which does not require RrmJ bound to the 50S ribosomal subunit. Because one of the three RrmJ homologues in yeast methylates tRNA instead of rRNA and because it has been shown in previous studies that RrmJ is able to recognize tRNA as methylation target as well, tRNA might be a possible candidate. Furthermore, the ribosomal profile of the rrmJ deletion strain when grown at heat shock temperatures suggested that RrmJ is not involved in ribosome assembly under these conditions. Therefore, it is likely that the methylation of the putative second substrate is RrmJ s heat shock function.
With the observation that RrmJ acts as a methyltransferase with dual substrate specificities and as ribosome assembly helper protein independent of its methylation activity it was now possible to understand many different phenotypes and effects that were observed in strains lacking this highly conserved protein.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Km, Vmax, Methyltransferase, 23S rRNA, enzyme, heat shock, ribosome, methylation, A-loop
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690HAGER, Jutta, 2005. Functional analysis of a heat shock inducible methyltransferase from Escherichia coli [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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June 21, 2005
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