Mechanismus und physiologische Bedeutung der MalK-vermittelten Repression des Escherichia-coli-Maltose-Regulons

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Mechanism and physiology of the MalK-mediated repression of the Escherichia coli maltose regulon
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Dissertation
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Zusammenfassung

Das Escherichia-coli-Maltosesystem besteht aus 10 Proteinen, die der Aufnahme und der Verwertung von Maltodextrinen dienen. Die Gene des Maltosesystems stehen unter Kontrolle des zentralen Aktivators MalT, der für die Transkription aller mal Gene essenziell ist. Durch Bindung des Induktors Maltotriose wird MalT von einer inaktiven in eine aktive Form überführt und stimuliert die Transkription des mal Regulons. Dem entgegen wirken eine Reihe von Proteinen, die die Expression der Maltosegene inhibieren. Eines dieser Proteine, MalK, ist die ATPase-Untereinheit des Maltodextrin-ABC-Transporters und selbst Teil des Maltosesystems. In dieser Arbeit wurden Studien zum Mechanismus und zur physiologischen Bedeutung der MalK-vermittelten Regulation des mal Regulons durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die MalK-vermittelte Repression auf einer Inhibition der MalT-Aktivität beruht. Darauf basierend wurden zwei Modelle zur Regulation des Maltosesystems gegenübergestellt. Darüber hinaus wurden Aspekte der Inducer Exclusion, des Transportmechanismus von ABC-Transportern und der Quartärstruktur von ABC-Transportern behandelt:
Eine Reihe von MalK Punktmutanten wurden isoliert, die spezifisch in ihrer Fähigkeit MalT zu inhibieren, gestört sind. Es wird postuliert, dass diese Mutanten eine verminderte Affinität von MalK zu MalT aufweisen. An Hand eines 3D-Modell des E. coli MalK Proteins wurde gezeigt, dass die Reste, die in diesen MalK Mutanten verändert sind, die MalT-Interaktionsstelle auf der Oberfläche der sogenannten regulatorischen Domäne von MalK definieren. Das 3D-Modell wurde weiterhin benutzt um bereits beschriebene Mutanten in einen strukturellen Kontext zu setzen. Dadurch wurden wichtige Beiträge zum Verständnis des Mechanismus der Inducer Exclusion und der Assemblierung von ABC-Transportern geleistet. Weiterhin wurden konservierte Sequenzmotive in der regulatorischen Domäne von ABC-Transportern entdeckt. Punktmutationen in diesen sogenannten "Regulatory Domain Motifs" von MalK führen zu einem transportnegativen Phänotyp der betroffenen Mutanten, der auf einer starken Verminderung der ATPase Aktivität beruht. Das ist ein Hinweis darauf, dass die regulatorische Domäne eine Rolle für die ATPase-Aktivität von MalK spielt. Dies ist bemerkenswert, da die regulatorische Domäne nur in einer Untergruppe aller prokaryotischen ABC-Transporter vorkommt und bisher angenommen wurde, dass alle ABC-Transporter den gleichen ATP-Hydrolyse-Mechanismus aufweisen.
In einer Reihe von in vitro Studien konnte bestätigt werden, dass MalK in Anwesenheit von ATP die MalT-Aktivität durch direkte Wechselwirkung inhibiert. Es wurden Hinweise gefunden, dass MalK in Anwesenheit von ADP zu einer Stimulation der MalT-Aktivität führt und dass MalT nicht nur mit cytoplasmatisch lokalisiertem MalK, sondern auch mit MalK im assemblierten Maltodextrin-ABC-Transporter interagiert. Dies ist konsistent mit einem neuen Modell der mal Genregulation: Dieses Modell besagt, dass die Bindung von Maltotriose zwar eine Vorraussetzung für MalT-Aktivität ist, die eigentliche Stimulation von MalT und damit die mal Genregulation aber durch die Transportrate des Maltodextrin-ABC-Transporters gesteuert wird.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

The Escherichia coli maltosesystem consists of 10 proteins, that serve the uptake and utilization of maltodextrins. The genes of the maltosesystem are under control of the central activator MalT, which is essential for the transcription of all mal genes. Through binding of the inducer maltotriose, MalT is shifted from an inactive into an active form and stimulates transcription of the mal regulon. A number of proteins have the opposite effect and inhibit the expression of the mal genes. One of these proteins, MalK, is the ATPase subunit of the maltodextrin ABC-transporter and is thus itself part of the maltodextrin system. In this work studies to elucidate the mechanism and physiological role of the MalK mediated regulation of the mal regulon have been carried out. It has been shown that the MalK mediated repression is due to an inhibition of the MalT activity. Based on this, two alternative models for the regulation of the maltosesystem have been proposed. Moreover, aspects of inducer exclusion, transport mechanistics and the quartenary structure of ABC-transporters have been addressed:
A number of malK point mutants have been isolated, that are specifically defective in their ability to inhibit MalT. It is postulated that these MalK variants have a decreased affinity towards MalT. By use of a 3D-model of the E. coli MalK protein it has been shown that residues that are altered in these malK mutants define a MalT-interaction site on the surface of the so called regulatory domain of MalK. In addition the 3D-model was used to put a number of mutations, that had been described before into a structural context. Thereby, important contributions to the understanding of inducer exclusion and the subunit assembly of ABC-transporters were made. Furthermore conserved sequence motifs in the regulatory domain of MalK have been discovered. Point mutations in these so called regulatory domain motifs of MalK lead to a transport negative phenotype of the respective mutants, this phenotype is based on a strong decrease of MalKs ATPase activity. This is an indication that the regulatory domain plays a role for MalKs ATPase activity. This is remarkable, because the regulatory domain is only present in a subset of all prokaryotic ABC-transporters, while it has been assumed that all ABC-transporters display the same mechanism of ATP hydrolysis.
In a number of in vitro experiments it could be confirmed that MalK inhibits MalT in the presence of ATP through a direct protein-protein interaction. Hints have been found that MalK leads to a stimulation of MalTs activity in the presence of ADP and that MalT not only interacts with cytoplasmically located MalK, but also interacts with MalK that is assembled in the maltodextrin ABC-transporter complex. This is consistent with a new model for mal gene regulation: This model predicts that the binding of maltotriose is in fact a prerequisite for the activity of MalT, but the actual stimulation of MalTs activity and thus the regulation of the mal genes is governed by the transport rate of the maltodextrin ABC-transporter.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
gene regulation, MalT, MalK, ABC-transporter
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690BÖHM, Alexander, 2002. Mechanismus und physiologische Bedeutung der MalK-vermittelten Repression des Escherichia-coli-Maltose-Regulons [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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November 8, 2002
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