Characterization of the ribosome-associated complex RAC from S. cerevisiae

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2011
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Zuotin and Ssz from yeast are members of the conserved Hsp40 and Hsp70 family of molecular chaperones, respectively, and are thought to be involved in the folding of newly synthesized proteins. Hsp70s use an ATP-controlled cycle for substrate binding and release which is regulated by their Hsp40 co-chaperones. However, in contrast to canonical Hsp70/40 members, Zuotin and Ssz form an unusually stable heterodimer termed ribosome-associated complex (RAC), which is bound to the ribosome. Thus RAC acts as a co-chaperone for another ribosome-bound Hsp70, Ssb. The aim of this thesis was to elucidate the unusual pairing of RAC and the influence of ATP on the complex by investigating the conformational changes and dynamics in solution. These conformational studies were performed using amide hydrogen exchange (HX) combined with high resolution mass pectrometry (MS). Additional analyses were conducted using mutational analyses, fluorescence measurements and electron paramagnetic resonance (EPR) measurements. HX-MS experiments with recombinant, purified S. cerevisiae Ssz, revealed specific ATP-induced conformational changes in Ssz individually and in complex. Upon ATP binding the nucleotide binding domain (NBD) was stabilized, resulting in a more compact structure. However, in contrast to canonical Hsp70s no influence of ATP binding on the substrate binding domain (SBD) was observed. Complex formation did not influence the nucleotide binding domain, but decreased the conformational dynamics within the SBD, indicating the engagement of the SBD in complex formation. Biochemical binding analysis of the individual domains NBD and SBD, respectively, revealed an interaction of the NBD of Ssz with the N-terminal domain of its complex partner Zuo. This indicates an involvement of both domains (NBD and SBD of Ssz) in complex formation of RAC. HX-MS experiments with recombinant, purified S. cerevisiae Zuo, revealed an extremely flexible region at the beginning of the N-terminal region of Zuo (aa 1 - 79). Upon complex formation this structure was conformationally stabilized, leaving only a short linker-like-region (aa 53 - 79) unstructured. Deletion of the highly flexible Nterminus of Zuo abolished stable association with Ssz in vitro and caused a phenotype resembling the loss of Ssz’s function in vivo. Thus, the C-terminal domain of Ssz, the N-terminal extension of Zuo and their mutual stabilization are the major structural determinants for RAC assembly. Moreover, HX-MS experiments revealed dynamic changes in the J-domain of Zuo upon complex formation that might be crucial for RAC’s co-chaperone function. Further EPR analysis using cysteine mutants of Zuo indicated that the conformational changes are not restricted to the interacting HPD motif itself but rather to the whole J-domain. The results obtained in this work allowed to develop a model presenting a novel mechanism for converting Zuo and Ssz chaperones into a functionally active heterodimer.
Summary in another language
Zuo und Ssz aus der Hefe gehören zu den hochkonservierten Familien der molekularen Hsp40 bzw. Hsp70 Chaperone. Es wird vermutet, dass Zuo and Ssz an der Faltung von neu synthetisierten Proteinen beteiligt sind. Hsp70 Chaperone nutzen einen ATP kontrollierten Zyklus für die Substratbindung und -freigabe, welcher von ihren Hsp40 Co-Chaperonen reguliert wird. Im Gegensatz zu typischen Hsp70/40 Mitgliedern bilden Ssz und Zuo ein ungewöhnlich, sehr stabiles Heterodimer, genannt Ribosome-Associated-Complex (RAC), welcher in der Lage ist an das Ribosom zu binden. Dort agiert RAC als Co-Chaperon für ein anderes ribosomgebundenes Hsp70 Chaperon, Ssb. Ziel dieser Arbeit war es, durch Untersuchung von Konformationsänderungen und der Dynamik der Wechselwirkungen von Zuo und Ssz aufzuklären, wie diese ungewöhnliche Paarung von RAC zustande kommt und welchen Einfluss ATP auf den Komplex hat. Diese Studien wurden mit Hilfe von Amid Hydrogen Austausch (HX) Experimenten in Verbindung mit hochauflösender Massenspektrometrie (MS) durchgeführt. Anschliessende Untersuchungen wurden mit Hilfe von Mutationsanalysen, Fluoreszenzmessungen und Elektronenspinresonanz (ESR) Messungen ausgeführt. Durch HX-MS Experimente mit rekombinant gereinigtem S.cerevisiae Ssz konnten spezifische ATP induzierte Konformationsänderungen in Ssz alleine wie auch im Komplex mit Zuo (RAC) gezeigt werden: Die Nukleotidebindedomäne (NBD) wird durch ATP-Bindung stabilisiert, was sich in einer kompakteren Struktur zeigt. Einen Einfluss der ATP-Bindung auf die Substratbindedomäne (SBD), wie sie typischer Weise bei klassischen Hsp70 Chaperonen zu finden ist, war jedoch nicht nachweisbar. Die Komplexbildung zeigte nur geringen Einfluss auf die NBD von Ssz, führte jedoch zu einer stark verringerten konformativen Dynamik innerhalb der Substratbindedomäne, was auf eine Beteiligung dieser Domäne an der Komplexbildung hindeutet. Biochemische Bindeanalysen der individuellen Domänen NBD und SBD von Ssz deuten daraufhin, dass auch die NBD mit der N-terminale Domäne von Zuo interagiert. Somit scheinen beide Domänen (NBD und SBD von Ssz) an der Komplexbildung von RAC beteiligt zu sein. HX-MS Experimente mit rekombinant gereinigtem S.cerevisiae Zuo ergaben eine extrem flexible Region am Beginn der N-terminalen Domäne von Zuo (aa 1 - 79). Die Bildung des Komplexes führte zu einer Stabilisierung der Konformation in dieser Struktur, lediglich ein kleiner, Linker ähnlicher Bereich (aa 53 - 79) blieb unstrukturiert. Die Deletion dieses hochflexiblen N-terminus von Zuo verhinderte eine stabile Interaktion mit Ssz in vitro und erzeugt einen Phänotypen in vivo der dem eines funktionslosen Ssz ähnelte. Zusammenfassend sind die SBD von Ssz, die N-terminale Region von Zuo und deren gegenseitige Stabilisierung die grundlegenden strukturellen Faktoren für die Assemblierung von RAC. Desweiteren zeigten die HX-MS Experimente eine dynamische Veränderung im Bereich der J-Domäne von Zuo, welche durch die Komplexbildung hervorgerufen wird und eine wichtige Rolle für die Co-Chaperon Funktion von RAC spielen könnte. Darauf aufbauende EPR Messungen mit Cysteinmutanten von Zuo wiesen darauf hin, dass die Konformationsänderungen sich wahrscheinlich nicht direkt auf das HPD-Motif selbst auswirken, sondern eher die gesamte J-Domäne betreffen. Die Ergebnisse dieser Arbeit führten zu Entwicklung eines Modells, welches einen neuartigen Mechanismus präsentiert, wie die Chaperone Zuo and Ssz zu einem funktionellen Heterodimer assembliert werden.
Subject (DDC)
570 Biosciences, Biology
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ISO 690HORST, Janina, 2011. Characterization of the ribosome-associated complex RAC from S. cerevisiae [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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