Influence of active nuclear transport on caspase-3 localization and apoptotic chromatin changes

Abstract

Die Effektorcaspase-3 nimmt in der Exekution der Apoptose eine zentrale Stellung ein. Als Antwort auf apoptotische Stimuli findet eine teilweise Umverteilung der primär cytoplasmatisch lokalisierten Protease in den Zellkern statt. Inwieweit dies auf passive Diffusion oder aktive Transportprozesse zurückzuführen ist, konnte bisher nicht beantwortet werden. Um diese Kontroverse zu klären, wurden in der vorliegenden Arbeit Mikroinjektionsexperimente dazu benutzt, die subzelluläre Lokalisation der Caspase-3 und den Mechanismus für den Übertritt in das Nukleoplasma zu untersuchen.Dazu wurde Caspase-3 in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Da das rekombinante Protein hohe DEVD-afc spaltende Aktivität aufwies, lag keine Beeinflussung der Protease durch die Fusion an GFP vor.Die Mikroinjektion aktiver Caspase-3 allein war ausreichend, apoptotische Veränderungen in der Zelle zu induzieren. Gleichzeitig zeigte ein schneller Anstieg der nukleären Fluoreszenz den Übertritt des Fusionsproteins in den Kern an. Die Beeinträchtigung der Selektivität der Kernporen konnte als Auslöser für die Translokation ausgeschlossen werden. Die Inhibition der Aktivität von Caspase-9 und Caspase-3 führte nicht zur Retention von Caspase-3 im Cytoplasma. Desweiteren war die Prozessierung der Caspase-3 nicht notwendig für eine effektive Anreicherung im Kern. Gleichzeitig blieb aber das signifikant kleinere Dextran40 aus dem Kern ausgeschlossen, was passive Diffusion von Caspase-3 unwahrscheinlich macht.Die Abhängigkeit der Caspase-3 Akkumulation von Energie und der Interaktion mit Nukleoporinen wies auf eine Beteiligung von aktiven Transportprozessen hin. Dieser Import erfolgte unabhängig von Importin β und Transportin. Eine Blockade dieser Transportwege konnte die Anreicherung der Caspase-3 im Kern nicht verhindern.Gleichzeitig zog die Inhibition des aktiven Imports eine Reduktion der Chromatinkondensation und der DNA Degradation nach sich. Für die Einleitung der Kernapoptose ist damit die Präsenz der Caspase-3 im Kern nicht essentiell notwendig. Stattdessen werden die benötigten Effektoren Importin β abhängig aus dem Cytosol importiert.Die Inhibition des Importin β vermittelten Transports führte zu einer Sensitivierung von HeLa Zellen auf TNFα. Damit wird deutlich, dass aktive Transportvorgänge sowohl für die Resistenz gegen TNFα vermittelte Apoptose als auch für die Durchführung der Kernapoptose unentbehrlich sind.