Influence of active nuclear transport on caspase-3 localization and apoptotic chromatin changes
Influence of active nuclear transport on caspase-3 localization and apoptotic chromatin changes
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2004
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Tautorat, Verena
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Einfluß des aktiven Kerntransports auf die Lokalisation der Caspase-3 und die apoptotischen Veränderungen des Chromatins
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Dissertation
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Abstract
Die Effektorcaspase-3 nimmt in der Exekution der Apoptose eine zentrale Stellung ein. Als Antwort auf apoptotische Stimuli findet eine teilweise Umverteilung der primär cytoplasmatisch lokalisierten Protease in den Zellkern statt. Inwieweit dies auf passive Diffusion oder aktive Transportprozesse zurückzuführen ist, konnte bisher nicht beantwortet werden. Um diese Kontroverse zu klären, wurden in der vorliegenden Arbeit Mikroinjektionsexperimente dazu benutzt, die subzelluläre Lokalisation der Caspase-3 und den Mechanismus für den Übertritt in das Nukleoplasma zu untersuchen.
Dazu wurde Caspase-3 in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Da das rekombinante Protein hohe DEVD-afc spaltende Aktivität aufwies, lag keine Beeinflussung der Protease durch die Fusion an GFP vor.
Die Mikroinjektion aktiver Caspase-3 allein war ausreichend, apoptotische Veränderungen in der Zelle zu induzieren. Gleichzeitig zeigte ein schneller Anstieg der nukleären Fluoreszenz den Übertritt des Fusionsproteins in den Kern an. Die Beeinträchtigung der Selektivität der Kernporen konnte als Auslöser für die Translokation ausgeschlossen werden. Die Inhibition der Aktivität von Caspase-9 und Caspase-3 führte nicht zur Retention von Caspase-3 im Cytoplasma. Desweiteren war die Prozessierung der Caspase-3 nicht notwendig für eine effektive Anreicherung im Kern. Gleichzeitig blieb aber das signifikant kleinere Dextran40 aus dem Kern ausgeschlossen, was passive Diffusion von Caspase-3 unwahrscheinlich macht.
Die Abhängigkeit der Caspase-3 Akkumulation von Energie und der Interaktion mit Nukleoporinen wies auf eine Beteiligung von aktiven Transportprozessen hin. Dieser Import erfolgte unabhängig von Importin β und Transportin. Eine Blockade dieser Transportwege konnte die Anreicherung der Caspase-3 im Kern nicht verhindern.
Gleichzeitig zog die Inhibition des aktiven Imports eine Reduktion der Chromatinkondensation und der DNA Degradation nach sich. Für die Einleitung der Kernapoptose ist damit die Präsenz der Caspase-3 im Kern nicht essentiell notwendig. Stattdessen werden die benötigten Effektoren Importin β abhängig aus dem Cytosol importiert.
Die Inhibition des Importin β vermittelten Transports führte zu einer Sensitivierung von HeLa Zellen auf TNFα. Damit wird deutlich, dass aktive Transportvorgänge sowohl für die Resistenz gegen TNFα vermittelte Apoptose als auch für die Durchführung der Kernapoptose unentbehrlich sind.
Dazu wurde Caspase-3 in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Da das rekombinante Protein hohe DEVD-afc spaltende Aktivität aufwies, lag keine Beeinflussung der Protease durch die Fusion an GFP vor.
Die Mikroinjektion aktiver Caspase-3 allein war ausreichend, apoptotische Veränderungen in der Zelle zu induzieren. Gleichzeitig zeigte ein schneller Anstieg der nukleären Fluoreszenz den Übertritt des Fusionsproteins in den Kern an. Die Beeinträchtigung der Selektivität der Kernporen konnte als Auslöser für die Translokation ausgeschlossen werden. Die Inhibition der Aktivität von Caspase-9 und Caspase-3 führte nicht zur Retention von Caspase-3 im Cytoplasma. Desweiteren war die Prozessierung der Caspase-3 nicht notwendig für eine effektive Anreicherung im Kern. Gleichzeitig blieb aber das signifikant kleinere Dextran40 aus dem Kern ausgeschlossen, was passive Diffusion von Caspase-3 unwahrscheinlich macht.
Die Abhängigkeit der Caspase-3 Akkumulation von Energie und der Interaktion mit Nukleoporinen wies auf eine Beteiligung von aktiven Transportprozessen hin. Dieser Import erfolgte unabhängig von Importin β und Transportin. Eine Blockade dieser Transportwege konnte die Anreicherung der Caspase-3 im Kern nicht verhindern.
Gleichzeitig zog die Inhibition des aktiven Imports eine Reduktion der Chromatinkondensation und der DNA Degradation nach sich. Für die Einleitung der Kernapoptose ist damit die Präsenz der Caspase-3 im Kern nicht essentiell notwendig. Stattdessen werden die benötigten Effektoren Importin β abhängig aus dem Cytosol importiert.
Die Inhibition des Importin β vermittelten Transports führte zu einer Sensitivierung von HeLa Zellen auf TNFα. Damit wird deutlich, dass aktive Transportvorgänge sowohl für die Resistenz gegen TNFα vermittelte Apoptose als auch für die Durchführung der Kernapoptose unentbehrlich sind.
Summary in another language
The subcellular localization of caspase-3 in a healthy cell was determined to be mainly cytosolic. In response to apoptotic stimuli, the apoptotic protease enters the nucleus. The mechanism employed remains the subject of controversy. In the presented study, the subcellular localization and the mechanism of nuclear entry of caspase-3 was studied employing a microinjection model.
For this purpose, recombinant caspase-3 was overexpressed in E. coli and isolated in high purity. Fusion of GFP did not affect the the proteolytic properties of the enzyme as demonstrated by strong DEVD-afc cleavage by the recombinant protease.
Injection of recombinant caspase-3 elicited the morphological features associated with apoptosis, accompanied by rapid equilibration of the apoptotic effector across the nuclear envelope. Both the inhibition of caspase-9 and caspase-3 activity failed to result in retention of the protease in the cytoplasm. Additionally, the rearrangement of the catalytic subunits following proteolytic activation of caspase-3 did not influence its cellular distribution. At the same time, the significantly smaller 40 kDa dextran was excluded from the nuclear compartment. Therefore, passive diffusion can be ruled out as the mode for caspase-3 entry into the nucleus.
The observed accumulation of caspase-3 in the nuclear compartment relied on active transport processes, as demonstrated by the requirement for interaction with nucleoporins and energy dependence. The hypothetical import factors utilized by caspase-3 do not belong to the family of importins or transportins, as inhibition of these pathways failed to block caspase-3 accumulation in the nucleoplasm.
Under conditions of import inhibition nuclear apoptosis is altered, as demonstrated by impaired chromatin condensation and DNA cleavage. The presence of caspase-3 was not required in the nucleus for the induction of these morphological features, indicating that the effectors are imported via an importin β dependent pathway from the cytosol following initiation of apoptosis.
Inhibition of the importin β pathway sensitized HeLa cells to apoptosis, probably by preventing NF-κB dependent activation of transcription. Therefore, active transport processes are indispensable for mediating cellular resistance in response to TNFα ligation, as well as the proper execution of nuclear apoptosis.
For this purpose, recombinant caspase-3 was overexpressed in E. coli and isolated in high purity. Fusion of GFP did not affect the the proteolytic properties of the enzyme as demonstrated by strong DEVD-afc cleavage by the recombinant protease.
Injection of recombinant caspase-3 elicited the morphological features associated with apoptosis, accompanied by rapid equilibration of the apoptotic effector across the nuclear envelope. Both the inhibition of caspase-9 and caspase-3 activity failed to result in retention of the protease in the cytoplasm. Additionally, the rearrangement of the catalytic subunits following proteolytic activation of caspase-3 did not influence its cellular distribution. At the same time, the significantly smaller 40 kDa dextran was excluded from the nuclear compartment. Therefore, passive diffusion can be ruled out as the mode for caspase-3 entry into the nucleus.
The observed accumulation of caspase-3 in the nuclear compartment relied on active transport processes, as demonstrated by the requirement for interaction with nucleoporins and energy dependence. The hypothetical import factors utilized by caspase-3 do not belong to the family of importins or transportins, as inhibition of these pathways failed to block caspase-3 accumulation in the nucleoplasm.
Under conditions of import inhibition nuclear apoptosis is altered, as demonstrated by impaired chromatin condensation and DNA cleavage. The presence of caspase-3 was not required in the nucleus for the induction of these morphological features, indicating that the effectors are imported via an importin β dependent pathway from the cytosol following initiation of apoptosis.
Inhibition of the importin β pathway sensitized HeLa cells to apoptosis, probably by preventing NF-κB dependent activation of transcription. Therefore, active transport processes are indispensable for mediating cellular resistance in response to TNFα ligation, as well as the proper execution of nuclear apoptosis.
Subject (DDC)
570 Biosciences, Biology
Keywords
Caspase-3,Chromatinkondensation,Kerntransport,DNA Fragmentierung,caspase-3,chromatin condensation,nuclear transport,DNA fragmentation
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ISO 690
TAUTORAT, Verena, 2004. Influence of active nuclear transport on caspase-3 localization and apoptotic chromatin changes [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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Examination date of dissertation
July 15, 2004