Molecular Analysis of the TRAIL DISC and its signalling pathways

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2003
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Sprick, Martin
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Dissertation
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Zusammenfassung

The TNF-receptor family plays a decisive role during the ontogenesis and homeostasis of multicellular organisms. This importance is apparent by the multitude of diseases which are caused by defects in either the ligands, receptors, or the associated signal transduction processes of the TNF family.
The receptors of the TNF family exert their effects mainly via two groups of intracellu-lar signal transduction pathways. Stimulation of the receptors of the TNF family in many cases leads to changes in gene expression. One important pathway in this process is the activation of the NF-kB signalling cascade. The second, equally important path-way utilized by members of the TNF family is the triggering of the caspase cascade. This pathway is utilized mainly by a subgroup of the TNF-receptor family, the death receptors. The death receptors are characterized by the presence of an intracellular protein domain, the death domain (DD). This domain is necessary for direct coupling of the death receptors to activation of the caspase cascade. Caspase activation occurs in a protein complex termed DISC (death inducing signalling complex). Amongst the death receptors, the TRAIL system stands out due to its complex receptor system. This consists of two death-receptors, TRAIL-R1 and TRAIL-R2 as well as two receptors con-taining no or a truncated death domain, TRAIL-R3 and R4, respectively. The cytokine TRAIL is of special interest due to its ability to kill tumor cells while normal cells are resistant to TRAIL. These properties make TRAIL a promising drug candidate for tumor therapy. Yet, preceding the clinical development, it is obligatory to better under-stand the molecular basis of the action and signalling of TRAIL. This knowledge will help to evaluate possible risks as well as fields of application.
At the beginning of this work, the composition of the TRAIL-DISC was controversially discussed. This was caused by the protein overexpression utilized in previous experiments.
In this work, a method was devised to isolate the native TRAIL-DISC for the first time. Using this method it was shown that the composition of the TRAIL-DISC identical to the CD95-DISC, regarding the already known components. It was shown that the initiator caspase, caspase-8 as well as the adaptor protein FADD are components of the TRAIL-DISC. Using cell lines deficient in either one of these two proteins it could further be shown that these two proteins are essential for normal apoptosis induction by TRAIL. It could further be shown that no qualitative difference exists between the TRAIL-R1 and TRAIL-R2 DISC.

The involvement of caspase-10 in TRAIL induced signal transduction has been discussed controversially as well. In this work, it could be shown that a majority of commercially available antibodies against this protein are unspecific. Using a specific anti-body, which was identified in this work, it was demonstrated that three caspase-10 isoforms are expressed in cell lines. For the first time it could be demonstrated that caspase-10, like caspase-8, is recruited to the native TRAIL- and CD95-DISC. Further, it was shown that caspase-10 cannot substitute for caspase-8 and thus, possibly serves a function different from apoptosis induction.
The results of this work are the basis for further studies of the signal transduction in the TNF-Receptor family, where still some fundamental questions are unresolved. One of these is unquestionably the function and of caspase-10 and the pathways, it is involved in.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Die TNF-Rezeptorfamilie spielt eine entscheidende Rolle bei der Ontogenese und Homöostase von vielzelligen Organismen. Deutlich wird diese wichtige Rolle durch eine Vielzahl von Erkrankungen, die durch Defekte in den Rezeptoren und Liganden der TNF-Familie oder durch Störung der durch diese Moleküle verwendeten Signalket-ten hervorgerufen werden.
Die Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie vermitteln ihre Effekte hauptsächlich mittels zwei Gruppen intrazellulärer Signaltransduktionswege. Die Stimulation von Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie führt in vielen Fällen zu einer Aktivierung von Signaltransduktionswegen, die eine Veränderung der Genexpression hervorrufen. Ein wichtiger Weg ist dabei sicherlich die Aktivierung der NF-kB Signalkaskade. Die zwei-te wichtige Signaltransduktionsmöglichkeit, die von den Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie verwendet wird, ist das Auslösen von Apoptose durch Aktivierung der Caspase-Kaskade. Dieser Signalweg wird hauptsächlich durch eine Subgruppe der TNF-Rezeptorfamilie verwendet, den so genannten Todesrezeptoren. Diese Rezeptor-gruppe ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein eines bestimmten Proteinmotivs in ihrem intrazellulären Teil, der Todesdomäne (DD). Diese Domäne ist nötig für die direkte Kopplung der Todesrezeptoren an die Aktivierung der Caspasen. Die Aktivierung der Caspasen erfolgt in einem Proteinkomplex, dem DISC (death inducing signaling complex, Tod induzierender Signalkomplex). Der DISC assembliert nach Stimulation der Todesrezeptoren an der Todesdomäne. Unter Todesrezeptoren ist das TRAIL-System herausragend durch sein komplexes Rezeptorsystem. Dieses besteht aus zwei Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, sowie zwei Rezeptoren die keine oder eine unvollständige Todesdomäne besitzen, nämlich TRAIL-R3 und TRAIL-R4. Das TRAIL-System ist von besonderem Interesse, da TRAIL in der Lage ist in Tumorzellen Apoptose auszulösen, während normale Körperzellen resistent gegen TRAIL sind. Diese Eigenschaften machen TRAIL zu einem viel versprechenden Wirkstoffkandidaten für die Tumortherapie. Vor der Weiterentwicklung für einen möglichen klinischen Einsatz ist es jedoch nötig, die Grundlagen der Signaltransduktion des TRAIL-Systems zu erforschen, um sowohl mögliche Einsatzgebiete als auch potentielle Risiken abzuschätzen.

Die Zusammensetzung des TRAIL-DISCs wurde zu Beginn dieser Arbeit kontrovers diskutiert. Dies war darauf zurückzuführen, dass vorherige Experimente mit Hilfe von Protein-Überexpressionsexperimenten durchgeführt wurden.
In dieser Arbeit konnte eine Methode entwickelt werden, um erstmals den nativen TRAIL-DISC zu isolieren. Mit Hilfe dieser Methode konnte gezeigt werden, dass der TRAIL-DISC in Bezug auf die bekannten intrazellulär rekrutierten Komponenten iden-tisch zu dem CD95-DISC ist. So sind im TRAIL-DISC sowohl die Initiatorcaspase Caspase-8 als auch das Adapterprotein FADD enthalten. Durch Verwendung von Zelllinien, die defizient in jeweils einem dieser beiden Proteine sind, konnte weiter gezeigt werden, dass diese beiden Proteine essentiell für die normale Apoptoseinduktion durch diese beiden Rezeptoren sind. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass es auf dieser Ebene keinen qualitativen Unterschied in der Zusammensetzung des TRAIL-R1- und des TRAIL-R2- DISCs gibt.

Die Beteiligung von Caspase-10 an der TRAIL-vermittelten Signaltransduktion wur-de ebenso kontrovers diskutiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass während ein Grossteil der kommerziellen Antikörper gegen Caspase-10 unspezifisch ist, mit Hilfe eines in dieser Arbeit identifizierten spezifischen Antikörpers die in Zellen exprimierten Caspase-10-Isoformen identifiziert werden können. Es konnte auch erstmalig gezeigt werden dass auch Caspase-10, wie Caspase-8 in dem nativen TRAIL- und CD95-DISC enthalten ist. Abschließend wurde gezeigt, dass Caspase-10 die Funktion von Caspase-8 nicht ersetzen kann, und somit möglicherweise primär nicht der Induktion von Apoptose, sondern vielmehr der Vermittlung von anderen Signalen dient.
Die Ergebnisse dieser Arbeit legen die Grundlage für weitere Untersuchungen der Signaltransduktion der TNF-Rezeptorfamilie, die noch einige offene Fragen bereithält. Eine dieser Fragen ist sicherlich die Funktion der Caspase-10 und Identität der Signalwege, an denen sie beteiligt ist.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Todesrezeptoren, TNF-Familie, Death receptors, TRAIL, TNF-Superfamily
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690SPRICK, Martin, 2003. Molecular Analysis of the TRAIL DISC and its signalling pathways [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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November 27, 2003
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