Chemical ubiquitylation of linker histone H1.2 by combining unnatural amino acids with click chemistry

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In eukaryotischen Zellen liegt die DNA komprimiert als Nucleoprotein-Komplex, auch bekannt als Chromatin, vor. Dabei ist die DNA in der untersten Organisationsstufe, dem Nukleosom, um ein Oktamer aus Kernhistonen gewickelt. Höher geordnete Strukturen werden durch Angliederung von Linker Histone gebildet. Die Mitglieder der Linker Histon Familie sind wie alle Histone hoch basische Proteine und bestehen aus einer gefalteten globulären Domäne (GD), die für die Erkennung und die Interaktion mit dem Nukleosom zuständig ist, sowie einer langen, unstrukturierten C-terminalen Region und einem kurzen N-terminalen Abschnitt. Die genaue Funktionsweise der Linker Histone bei der Ausbildung höher geordneter Chromatinstrukturen ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Ein Aspekt der Regulation der Chromatinstruktur und damit vieler DNA basierender Prozesse, wird durch Histonmodifikationen wie z. B. Methylierung, Acetylierung und Ubiquitylierung gesteuert. Die Diversität dieser posttranslationalen Modifikationen (PTMs) und der daraus resultierenden Funktionen führte zur Formulierung der Histone Code Hypothese. Unter der Vielzahl verschiedener PTMs gehört die Mono-Ubiquitylierung zu einer der am wenigsten verstandenen epigenetischen Markierungen. Insbesondere über die Mono-Ubiquitylierung von Linker Histonen ist sehr wenig bekannt. Eine Ursache dafür liegt in der Unzugänglichkeit von homogen modifizierten Linker Histonen, welche für genauere Untersuchungen unabdingbar sind. Ziel dieser Arbeit war daher die Herstellung von definierten, mono-ubiquitylierten linker Histonen mittels Click Reaktion, sowie deren funktionelle Charakterisierung. Um die mono-ubiquitylierten Linker Histone der Variante H1.2 mittels Click Reaktionen herzustellen, wurden unnatürliche Aminosäuren, die über eine Alkin- bzw. Azidgruppe verfügen, an verschiedenen Positionen in die jeweiligen Proteine eingebaut. Nach Optimierung der Expression sowie der Reinigung von H1.2 gelang es, das propargyl-derivatisierte Lysine Plk mittels Amber Codon Suppression (ACS) gezielt in vier verschiedenen Positionen innerhalb der GD einzubauen und die modifizierten Proteine erfolgreich zu isolieren. Die C-terminale Azid-Modifikation von Ubiquitin (Ub) wurde durch den Einbau von Azidohomoalanin (Aha) mittels Selecitve Pressure Incorporation (SPI) erreicht. Nach intensiver Optimierung der Click Reaktionsbedingungen, konnte H1.2 an allen vier gewünschten Positionen mit Ub kovalent modifiziert werden. Die erfolgreiche Konjugation wurde mittels Massen-spektrometrie (MS) bestätigt. Weiterhin zeigten alle H1.2-Ub Konjugate in CD spektroskopischen Studien eine korrekte, dem unmodifizierten Wildtyp entsprechende Faltung. Anschließend wurde die Fähigkeit der H1.2-Ub Konjugate zur Binding an Nukleosomen und zur Assemblierung von Chromatosomen untersucht. Dazu wurden definierte Nukleosomen aufgebaut und die Bildung von Chromatosomen sowie deren Eigenschaften untersucht. Hier zeigte sich, dass alle Konjugate, unabhängig von der Position der Mono-Ubiquitylierung, in der Lage sind, die nukleosomale Struktur zu erkennen und Chromatosomen aufzubauen. Dies weist auf variable Bindungsformen von H1 am Nukleosom hin, welche bereits zuvor beschrieben wurden. Um die mono-ubiquitylierten Konjugate als putative Vorlagen für weitere PTMs genauer zu beleuchten, wurde ihre Eignung als Substrat für Linker Histone-modifizierende Enzyme untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass H1.2-Ub Konjugate trotz Mono-Ubiquitylierung Akzeptoren für die Phosphorylierung durch den Kinasekomplex cdk1/cyclin B darstellen. Diese Ergebnisse wurden so-wohl in in vitro als auch in ex vivo Experimenten erhalten und demonstrieren, dass die mittels Click Reaktion hergestellten H1.2-Ub Konjugate auch in komplexen, biologischen Systemen einsetzbar sind. Abschließende Studien mit Poly(ADP-ribose)-Polymerase 1 (PARP-1) deuteten an, dass die Mono-Ubiquitylierung der globulären Domäne in H1.2 keinen wesentlichen Einfluss auf die Umgestaltung der Chromatosomen durch PARP-1 hat, obwohl die H1.2-Ub Konjugate als Akzeptoren für poly(ADP-ribos)ylierung fungieren und aus H1.2-Ub bestehende Chromatosomen mit PARP-1 interagieren.

Fachgebiet (DDC)
540 Chemie
Schlagwörter
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690RÖSNER, Daniel, 2016. Chemical ubiquitylation of linker histone H1.2 by combining unnatural amino acids with click chemistry [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Prüfungsdatum der Dissertation
March 24, 2016
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Konstanz, Univ., Diss., 2016
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