Modeling DNA Hairpins

Abstract

DNA beacons bestehen aus kurzen DNA Einzelsträngen, die komplementäre Sequenzen in den Regionen der zwei Enden aufweisen. Die Endregionen eines Einzelstrangs können aufgrund dieser Eigenschafteine kurze DNA Doppelhelix bilden, die mit StanHIl bezeichnet wird. Der verbleibende zentrale Teil des Strangs formt eine Windung, den so genannten Loop. In dieser geschlossenen Anordnung bildet der Einzelstrang eine Hairpin-Struktur. Hairpins spielen eine besondere Rolle für die Bestimmung der Sekundärstruktur langer DNA- oder RNA-Einzelstränge. Ein kurzer DNA Einzelstrang, der eine Hairpin-Struktur bilden kann, formt einen so genannten DNA beacon, wenn ein Ende mit eine fluoreszierenden Marker und das andere Ende mit einem Quencher versehen wird. Sind diese Marker nur wenige Angström voneinander entfernt, so verschwindet die Fluoreszenz durch direkten Energietransfer vom fluoreszierenden Molekül zum Quencher. F()lglich ist für einen geschlossenen Hairpin keine Fluoreszenz zu beobachten, sie tritt jedoch erneut auf, sobald das Molekül seine Struktur verändert. Diese Eigenschaft ermöglicht den Einsatz molekularer beacons für zahlreiche Anwendungen in der Physik und Biologie. Biologische Anwendungen nutzen die Bildung von Komplexen, bestehend aus dem Einzelstrang, der den Loop beinhaltet, und einem weiteren komplementären DNA Strang. Die Komplexbildung zu einer Doppelhelix erzwingt die Entfaltung des Hairpins, und ein Fluoreszenzsignal wird messbar. In diesem Zusammenhang wurde erwogen, dass DNA beacons in vivo dazu verwendet werden könnten, um einzelne RN A Stränge, die im Verlaufe der Transkription von Genen synthetisiert werden, nachzuweisen. Auf diese Weise wäre es möglich, Krebszellen zu erkennen, indem man gezielt einige Gene beobachtet, die besonders oft in den Krebszellen entschlüsselt werden.Auch für die Physik sind DNA beacons von besonderem Interesse. Sie können beispielsweise für das Auslesen molekularer Speichereinheiten oder für molekulare Rechenvorgänge verwendet werden. Ihre herausragende Eigenschaft im Hinblick auf das Thema der vorliegenden Arbeit ist ihre Fähigkeit, den Vorgang des Öffnens und des Schließens von DNA Hairpins akkurat wiederzugeben. Eine "Schmelzkurve" des Stamms, hervorgerufen durch Erhitzen, kann auf diese Weise gegen die Temperatur aufgetragen werden; die Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenz ermöglicht es, die Kinetik des Öffnens/Schließens zu bestimmen. Es existieren zahlreiche solcher Messungen für unterschiedliche Loop-Längen und Sequenzen, sie bilden einen vollständigen Datensatz und können dazu verwendet werden, das Verständnis der Eigenschaften von DNA Hairpins zu erweitern. Dies ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Die Untersuchungen in dieser Arbeit gehen über die Eigenschaften von Hairpins hinaus, da, wie im folgenden gezeigt wird, die Ergebnisse sehr wesentlich von den Eigenschaften des Loops abhängen. Der Vergleich zwischen experimentellen Daten und den Ergebnissen unterschiedlicher Modelle ist daher ein empfindlicher Test für das theoretische Verständnis der Physik einzelner DNA Stränge. Dies schließt Probleme in anderen Bereichen, so zum Beispiel die Modellierung der Eigenschaften von RNA, mitein.In dieser Arbeit werden zwei Modelle vorgestellt, die die Thermodynamik und die Kinetik solcher Systeme untersuchen. Das erste Modell ist ein zweidimensionales Gittermodell, das auf den ittermodellen für die Untersuchung der Proteinfaltung beruht. Die Energie des Einzelstrangs wird darin aus lediglich zwei Beiträgen berecllnet, einem Beitrag der Krümmungsenergie, die für zueinander rechtwinklig angeordnete Segmente auftritt, und einem Beitrag aus der Bindung von Basenpaaren, die den Stamm bilder!. Mithilfe von Monte Carlo Simulationen können die Eigenschaften im thermodynamischen Gleichgewicht und die Kinetik des Systems untersucht werden. Die Ergebnisse stimmen qualitativ mit experimentellen Beobachtungen überein und zeigen, dass die wesentlichen Eigenschaften von DNA Hairpins auf sehr einfache theoretische Überlegungen zurückgeführt werden können. Gleichwohl liegt die Hauptschwäche dieses Modells in der geringen Anzahl von Freiheitsgraden, so dass ein quantitativer Vergleich mit Experimenten nicht möglich ist. Aus diesem Grund wurde ein weiteres Modell entwickelt, das die physikalischen Eigenschaften des Gittermodells berücksichtigt, jedoch auf die räumliche Einschränkung des Gitters verzichtet. Das Modell verknüpft Ideen aus der Polymertheorie mit dem Peyrard-Bishop-Dauxois (PBD) Modell für DNA Schmelzen, und unterteilt ein Hairpin Molekül in zwei Untersysteme:den Loop, der als Polymer modelliert wird,den Stamm, wiedergegeben durch das PBD Modell unter Verwendung zusätzlicher Terme, die das \Vachstum des Loops im Stamm mit in Betracht ziehen.Dieser neue Zugang ermöglicht es, einen quantitativen Vergleich mit experimentell ermittelten Daten durchzuführen. Es zeigt sich, dass eine gute Übereinstimmung bezüglich der Abhängigkeit der Schmelztemperatur von den Eigenschaften des Loops (Länge und Sequenz) erzielt wird. Ein weiteres Ergebnis ist der Befund, dass die Kinetik des Öffnungsprozesses lediglich von den Eigenschaften des Stamms abhängt und die Rate des Schließungsprozesses mit steigender Loop-Länge alJIlimmt. Dessen ungeachtet ist es nicht möglich, eine quantitative Übereinstimmung mit allen experimentellen Beobachtungen zu erreichen. So ist das experimentell bestimmte Temperaturintervall, in dem der Übergang stattfindet, deutlich kleiner als durch das Modell vorhergesagt, nabhängig von der genauen Modellierung des Loops. Obzwar diese Feststellung enttäuschen mag, ist dieses negative Ergebnis möglicherweise die zentrale Aussage der vorliegenden Arbeit: Auf der Längenskala von wenigen Dutzend Basenpaaren kann DNA nicht durch die klassische Polymertheorie erfasst werden, im 'Widerspruch zu gegenteiligen Behauptungen in der Literatur. Tatsächlich erwendet ein Teil der Studien, die zu solchen Behauptungen kommen, wesentlich längere Segmente, und die lokalen strukturellen Eigenschaften der DNA treten aufgrund von Mittelung nicht hervor. Der andere Teil der Studien schließt experimentelle Beobachtungen bereits in die Modellierung mitein, so dass die Abweichungen vom Polymerverhalten in den Ergebnissen nicht offensichtlich werden.