Modeling DNA Hairpins

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Datum
2007
Autor:innen
Errami, Jalal
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Publikationstyp
Dissertation
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Zusammenfassung

DNA beacons bestehen aus kurzen DNA Einzelsträngen, die komplementäre Sequenzen in den Regionen der zwei Enden aufweisen. Die Endregionen eines Einzelstrangs können aufgrund dieser Eigenschafteine kurze DNA Doppelhelix bilden, die mit StanHIl bezeichnet wird. Der verbleibende zentrale Teil des Strangs formt eine Windung, den so genannten Loop. In dieser geschlossenen Anordnung bildet der Einzelstrang eine Hairpin-Struktur. Hairpins spielen eine besondere Rolle für die Bestimmung der Sekundärstruktur langer DNA- oder RNA-Einzelstränge. Ein kurzer DNA Einzelstrang, der eine Hairpin-Struktur bilden kann, formt einen so genannten DNA beacon, wenn ein Ende mit eine fluoreszierenden Marker und das andere Ende mit einem Quencher versehen wird. Sind diese Marker nur wenige Angström voneinander entfernt, so verschwindet die Fluoreszenz durch direkten Energietransfer vom fluoreszierenden Molekül zum Quencher. F()lglich ist für einen geschlossenen Hairpin keine Fluoreszenz zu beobachten, sie tritt jedoch erneut auf, sobald das Molekül seine Struktur verändert. Diese Eigenschaft ermöglicht den Einsatz molekularer beacons für zahlreiche Anwendungen in der Physik und Biologie. Biologische Anwendungen nutzen die Bildung von Komplexen, bestehend aus dem Einzelstrang, der den Loop beinhaltet, und einem weiteren komplementären DNA Strang. Die Komplexbildung zu einer Doppelhelix erzwingt die Entfaltung des Hairpins, und ein Fluoreszenzsignal wird messbar. In diesem Zusammenhang wurde erwogen, dass DNA beacons in vivo dazu verwendet werden könnten, um einzelne RN A Stränge, die im Verlaufe der Transkription von Genen synthetisiert werden, nachzuweisen. Auf diese Weise wäre es möglich, Krebszellen zu erkennen, indem man gezielt einige Gene beobachtet, die besonders oft in den Krebszellen entschlüsselt werden.
Auch für die Physik sind DNA beacons von besonderem Interesse. Sie können beispielsweise für das Auslesen molekularer Speichereinheiten oder für molekulare Rechenvorgänge verwendet werden. Ihre herausragende Eigenschaft im Hinblick auf das Thema der vorliegenden Arbeit ist ihre Fähigkeit, den Vorgang des Öffnens und des Schließens von DNA Hairpins akkurat wiederzugeben. Eine "Schmelzkurve" des Stamms, hervorgerufen durch Erhitzen, kann auf diese Weise gegen die Temperatur aufgetragen werden; die Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenz ermöglicht es, die Kinetik des Öffnens/Schließens zu bestimmen. Es existieren zahlreiche solcher Messungen für unterschiedliche Loop-Längen und Sequenzen, sie bilden einen vollständigen Datensatz und können dazu verwendet werden, das Verständnis der Eigenschaften von DNA Hairpins zu erweitern. Dies ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Die Untersuchungen in dieser Arbeit gehen über die Eigenschaften von Hairpins hinaus, da, wie im folgenden gezeigt wird, die Ergebnisse sehr wesentlich von den Eigenschaften des Loops abhängen. Der Vergleich zwischen experimentellen Daten und den Ergebnissen unterschiedlicher Modelle ist daher ein empfindlicher Test für das theoretische Verständnis der Physik einzelner DNA Stränge. Dies schließt Probleme in anderen Bereichen, so zum Beispiel die Modellierung der Eigenschaften von RNA, mitein.
In dieser Arbeit werden zwei Modelle vorgestellt, die die Thermodynamik und die Kinetik solcher Systeme untersuchen. Das erste Modell ist ein zweidimensionales Gittermodell, das auf den ittermodellen für die Untersuchung der Proteinfaltung beruht. Die Energie des Einzelstrangs wird darin aus lediglich zwei Beiträgen berecllnet, einem Beitrag der Krümmungsenergie, die für zueinander rechtwinklig angeordnete Segmente auftritt, und einem Beitrag aus der Bindung von Basenpaaren, die den Stamm bilder!. Mithilfe von Monte Carlo Simulationen können die Eigenschaften im thermodynamischen Gleichgewicht und die Kinetik des Systems untersucht werden. Die Ergebnisse stimmen qualitativ mit experimentellen Beobachtungen überein und zeigen, dass die wesentlichen Eigenschaften von DNA Hairpins auf sehr einfache theoretische Überlegungen zurückgeführt werden können. Gleichwohl liegt die Hauptschwäche dieses Modells in der geringen Anzahl von Freiheitsgraden, so dass ein quantitativer Vergleich mit Experimenten nicht möglich ist. Aus diesem Grund wurde ein weiteres Modell entwickelt, das die physikalischen Eigenschaften des Gittermodells berücksichtigt, jedoch auf die räumliche Einschränkung des Gitters verzichtet. Das Modell verknüpft Ideen aus der Polymertheorie mit dem Peyrard-Bishop-Dauxois (PBD) Modell für DNA Schmelzen, und unterteilt ein Hairpin Molekül in zwei Untersysteme:
den Loop, der als Polymer modelliert wird,
den Stamm, wiedergegeben durch das PBD Modell unter Verwendung zusätzlicher Terme, die das \Vachstum des Loops im Stamm mit in Betracht ziehen.
Dieser neue Zugang ermöglicht es, einen quantitativen Vergleich mit experimentell ermittelten Daten durchzuführen. Es zeigt sich, dass eine gute Übereinstimmung bezüglich der Abhängigkeit der Schmelztemperatur von den Eigenschaften des Loops (Länge und Sequenz) erzielt wird. Ein weiteres Ergebnis ist der Befund, dass die Kinetik des Öffnungsprozesses lediglich von den Eigenschaften des Stamms abhängt und die Rate des Schließungsprozesses mit steigender Loop-Länge alJIlimmt. Dessen ungeachtet ist es nicht möglich, eine quantitative Übereinstimmung mit allen experimentellen Beobachtungen zu erreichen. So ist das experimentell bestimmte Temperaturintervall, in dem der Übergang stattfindet, deutlich kleiner als durch das Modell vorhergesagt, nabhängig von der genauen Modellierung des Loops. Obzwar diese Feststellung enttäuschen mag, ist dieses negative Ergebnis möglicherweise die zentrale Aussage der vorliegenden Arbeit: Auf der Längenskala von wenigen Dutzend Basenpaaren kann DNA nicht durch die klassische Polymertheorie erfasst werden, im 'Widerspruch zu gegenteiligen Behauptungen in der Literatur. Tatsächlich erwendet ein Teil der Studien, die zu solchen Behauptungen kommen, wesentlich längere Segmente, und die lokalen strukturellen Eigenschaften der DNA treten aufgrund von Mittelung nicht hervor. Der andere Teil der Studien schließt experimentelle Beobachtungen bereits in die Modellierung mitein, so dass die Abweichungen vom Polymerverhalten in den Ergebnissen nicht offensichtlich werden.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

DNA beacons are made of short single strands of DNA with terminal regions consisting of complementary base sequences. As a result, the two end-regions can self-assemble in a short DNA double helix, called the stern, while the remaining central part of the strand makes a loop. In this closed configuration, the single strand has the shape of a hairpin. Such hairpin conformations are important in determining the secondary structure of long single strands of DNA or RNA. A short single strand of DNA which can form a hairpin ecomes a so-called « DNA beacon » when one of its cmds is attached to a fluorophore while the second end is attached to a quencher. When the fluorophore and the quencher are within a few Angströms, the fluorescence is quenched due to direct energy transfer from the fluorophore to the quencher. As a result, in a closed hairpin configuration, the beacon is not fluorescent, while in the open configuration it becomes fluorescent. This property opens many interesting applications for molecular beacons in biology or physics. Biological applications use the possible assembly of the single strand which forms the loop with another DNA strand which is complementary to the sequence of the loop. The assembly of a double helix replacing the single strand of the loop forces the opening of the hairpin, lcwling to a fluorescent signal. This technique provides very sensitive probes for sequences which are complementary to the loop. In the same spirit it has been suggested that DNA beacons could be used in vivo to detect the single stranded RNA which is synthetized during the transcription of genes. This opens the possibility to recognise cancer cells by targeting some genes which are heavily transcribed in such cells.
For physics DNA beacons are very interesting too. They can for installCe be used as the basis of some devices such as molecular memories read by the detection of fluorescence, or to perform molecular computation. The most important aspect for our purpose is that molecular beacons allow accurate observations of the opening and closing of DNA hairpins. The « melting profile» of the stern, induced by heating, can be recorded accurately versus temperature and the auto-correlation function of the fluorescence can be used to extract the kinetics of the opening/closing fluctuations. Measurements have been made for different loop lengths and different bases in the loop, providing a complete set of data which can be used to understand what governs the properties of DNA hairpins. This is the goal of this thesis. The analysis go es beyond the properties of hairpins themselves because, as shown below, the results are very sensitive to the properties of the loop. Therefore the comparison of experimental data with the results of various models is a very sensitive test of our ability to model single strands of DNA. This is important in other related contexts such as the properties of RNA.
We have developed two different models in order to study the thermodynamics and the kinetics of such systems. The first one is a plan ar square lattice model inspired by the lattice models which have been used to study protein folding. The energy of the DNA strand depends on two terms only, a bending energy when two consecutive segments form a right angle and the energy of the base-pair which can form in the stem. Using Monte Carlo simulation, we cornpute the equilibrium properties and the kinetics of the system. The results obtained by this model are in qualitative agreement with the experiments showing that the main properties of DNA hairpin rely on very simple and general ideas. Nevertheless, the main weakness of the model is that it does not have enough degrees of freedom, so that a quantitative comparison with experiments is not possible. Therefore we have proposed another model which includes the physical ingredients of the lattice model but without the constraint of the lattice. It combines polymer theory and the Peyrard-Bishop and Dauxois (PBD) model of DNA melting. The model treats the hairpin as consisting of two subsystems:
the loop which is modelled by a polymer
the stern which is modelled by the PBD additional terms that take into account the growth of the loop inside the stem.
With this approach we can compare our results quantitatively with the experimental ones.We find a good agreement for the dependence of the melting temperature with the characteristics of the loop, i.e. the length and the nature of the sequence. Moreover the kinetic results are in qualitative agreement with the experiments. We find that the kinetics of opening is governed by the stern only and that the rate of closing decreases with the length of the loop. However we are not able to get a quantitative agreement with experiments on all aspcKts. The temperature range in which the transition takes place in the experiments is much narrower than given by the model, irrespectively of the model that we choose for the loop. Although it sounds disappointing, this negative result is perhaps the most important in the thesis because we show clearly that a single strand of DNA cannot be modelled as a simple polymer on a length scale of the order of a few tens of base-pairs, in spite of the claims in the literature that such a picture is valid. Actually studies that claim the validity of such a description either consider much longer segments over which the subtleties of DNA structure are averaged out, or only take into account some aspects of the experimental results so that the discrepancies are hidden.

Fachgebiet (DDC)
530 Physik
Schlagwörter
DNA, Kratky-Porod-Modell, DNA hairpins, stem, loop, DNA beacons, polymer theory, PBD-model
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690ERRAMI, Jalal, 2007. Modeling DNA Hairpins [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Sie können beispielsweise für das Auslesen molekularer Speichereinheiten oder für molekulare Rechenvorgänge verwendet werden. Ihre herausragende Eigenschaft im Hinblick auf das Thema der vorliegenden Arbeit ist ihre Fähigkeit, den Vorgang des Öffnens und des Schließens von DNA Hairpins akkurat wiederzugeben. Eine "Schmelzkurve" des Stamms, hervorgerufen durch Erhitzen, kann auf diese Weise gegen die Temperatur aufgetragen werden; die Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenz ermöglicht es, die Kinetik des Öffnens/Schließens zu bestimmen. Es existieren zahlreiche solcher Messungen für unterschiedliche Loop-Längen und Sequenzen, sie bilden einen vollständigen Datensatz und können dazu verwendet werden, das Verständnis der Eigenschaften von DNA Hairpins zu erweitern. Dies ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Die Untersuchungen in dieser Arbeit gehen über die Eigenschaften von Hairpins hinaus, da, wie im folgenden gezeigt wird, die Ergebnisse sehr wesentlich von den Eigenschaften des Loops abhängen. Der Vergleich zwischen experimentellen Daten und den Ergebnissen unterschiedlicher Modelle ist daher ein empfindlicher Test für das theoretische Verständnis der Physik einzelner DNA Stränge. Dies schließt Probleme in anderen Bereichen, so zum Beispiel die Modellierung der Eigenschaften von RNA, mitein.&lt;br /&gt;In dieser Arbeit werden zwei Modelle vorgestellt, die die Thermodynamik und die Kinetik solcher Systeme untersuchen. Das erste Modell ist ein zweidimensionales Gittermodell, das auf den ittermodellen für die Untersuchung der Proteinfaltung beruht. Die Energie des Einzelstrangs wird darin aus lediglich zwei Beiträgen berecllnet, einem Beitrag der Krümmungsenergie, die für zueinander rechtwinklig angeordnete Segmente auftritt, und einem Beitrag aus der Bindung von Basenpaaren, die den Stamm bilder!. Mithilfe von Monte Carlo Simulationen können die Eigenschaften im thermodynamischen Gleichgewicht und die Kinetik des Systems untersucht werden. Die Ergebnisse stimmen qualitativ mit experimentellen Beobachtungen überein und zeigen, dass die wesentlichen Eigenschaften von DNA Hairpins auf sehr einfache theoretische Überlegungen zurückgeführt werden können. Gleichwohl liegt die Hauptschwäche dieses Modells in der geringen Anzahl von Freiheitsgraden, so dass ein quantitativer Vergleich mit Experimenten nicht möglich ist. Aus diesem Grund wurde ein weiteres Modell entwickelt, das die physikalischen Eigenschaften des Gittermodells berücksichtigt, jedoch auf die räumliche Einschränkung des Gitters verzichtet. 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May 11, 2007
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