Studien zum Substratspektrum von DNA-Polymerasen
Studien zum Substratspektrum von DNA-Polymerasen
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2007
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Detmer, Ilka
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Additional substrates for DNA polymerases
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Dissertation
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Abstract
An essential prerequisite for all organisms is to keep its genome intact and to accurately duplicate it prior to cell division. All DNA synthesis is catalyzed by DNA polymerases, which play a crucially role in the accuracy of informationtransfer. The fidelity of DNA replication depends on the ability of DNA polymerases to recognize the template and insert the accurat nucleotide according to Watson-Crick basepairing.
During DNA replication not only the incorporation of the accurat nucleobase, but also the configuration of the ribose unit seems to be regulated, as natural DNA and RNA is exclusively composed of D-enantiomers. So far it has not been understood how nature has chosen and retained chirality of DNA biosynthesis during evolution. The differentiation between the two stereoisomers requires specific contacts of the DNA polymerases with the sugar residues of the substrates in addition to the interactions with the nucleobase, which ensure selective formation of Watson-Crick basepairs.
The aim of this work was to evolve a DNA polymerase with the ability to incorporate L-nucleotides.
We designed preliminary experiments, testing several commercially available DNA polymerases from different distinct DNA polymerase families for their ability to incorporate L-thymidinetriphosphate (L-TTP). Out of those DNA polymerases, the Therminator DNA polymerase stood out due to its ability to catalyze the insertion of two L-TTP. This property appears to be related to a mutation in its finger domain.
Based on these results, DNA polymerases with improved properties should have been generated using the directed evolution approach. Therefore, two evolution systems were used.
During DNA replication not only the incorporation of the accurat nucleobase, but also the configuration of the ribose unit seems to be regulated, as natural DNA and RNA is exclusively composed of D-enantiomers. So far it has not been understood how nature has chosen and retained chirality of DNA biosynthesis during evolution. The differentiation between the two stereoisomers requires specific contacts of the DNA polymerases with the sugar residues of the substrates in addition to the interactions with the nucleobase, which ensure selective formation of Watson-Crick basepairs.
The aim of this work was to evolve a DNA polymerase with the ability to incorporate L-nucleotides.
We designed preliminary experiments, testing several commercially available DNA polymerases from different distinct DNA polymerase families for their ability to incorporate L-thymidinetriphosphate (L-TTP). Out of those DNA polymerases, the Therminator DNA polymerase stood out due to its ability to catalyze the insertion of two L-TTP. This property appears to be related to a mutation in its finger domain.
Based on these results, DNA polymerases with improved properties should have been generated using the directed evolution approach. Therefore, two evolution systems were used.
Summary in another language
Eine Vorraussetzung für das Überleben eines jeden Organismus ist die Konservierung seines Genoms und dessen exakte Verdopplung während der Zellteilung. Die gesamte in der Natur vorkommende DNA-Synthese wird von DNA-Polymerasen katalysiert, die entscheidend an der Genauigkeit des dabei auftretenden Informationstransfers beteiligt sind. Die Genauigkeit der DNA-Replikation, d.h. die Erstellung einer exakten Kopie des doppelsträngigen Elterngenoms, hängt dabei von der Fähigkeit der DNA-Polymerase ab, das Templat zu erkennen und die komplementären Nucleotide nach der Watson-Crick Regel einzubauen.
Bei der DNA-Replikation scheint aber nicht nur die Wahl der richtigen Nucleobase kontrolliert zu werden, sondern auch die Konfiguration des Zuckers, die bei natürlicher DNA und RNA ausschließlich aus dem D-Stereoisomer besteht. Bis heute ist nicht verstanden, wie in der Natur die Chiralität der DNA-Biosynthese während der Evolution erreicht und beibehalten wurde. Um zwischen den zwei Stereoisomeren zu unterscheiden, müssen DNA-Polymerasen relevante Wechselwirkungen mit dem Zuckerrest der Nucleotide zusätzlich zu den Wechselwirkungen mit den Nucleobasen eingehen.
Ziel dieser Arbeit war eine DNA-Polymerase zu evolvieren, die in der Lage ist L-Nucleotide einzubauen.
In eigenen Vorexperimenten wurden verschiedene DNA-Polymerasen aus unterschiedlichen Strukturfamilien auf ihre Einbaufähigkeit von L-Thymidintriphosphaten (L-TTP) getestet. Daraus wurde die Therminator DNA-Polymerase identifiziert, die den Einbau von zwei L-TTP katalysiert. Diese Fähigkeit konnte auf eine Mutation im Fingerbereich des Enzyms zurückgeführt werden.
Auf diesen Ergebnissen aufbauend, sollten DNA-Polymerasen mit verbesserter Einbaufähigkeit durch gerichtete Evolution generiert werden. Dafür wurden zwei Evolutionssysteme getestet.
Bei der DNA-Replikation scheint aber nicht nur die Wahl der richtigen Nucleobase kontrolliert zu werden, sondern auch die Konfiguration des Zuckers, die bei natürlicher DNA und RNA ausschließlich aus dem D-Stereoisomer besteht. Bis heute ist nicht verstanden, wie in der Natur die Chiralität der DNA-Biosynthese während der Evolution erreicht und beibehalten wurde. Um zwischen den zwei Stereoisomeren zu unterscheiden, müssen DNA-Polymerasen relevante Wechselwirkungen mit dem Zuckerrest der Nucleotide zusätzlich zu den Wechselwirkungen mit den Nucleobasen eingehen.
Ziel dieser Arbeit war eine DNA-Polymerase zu evolvieren, die in der Lage ist L-Nucleotide einzubauen.
In eigenen Vorexperimenten wurden verschiedene DNA-Polymerasen aus unterschiedlichen Strukturfamilien auf ihre Einbaufähigkeit von L-Thymidintriphosphaten (L-TTP) getestet. Daraus wurde die Therminator DNA-Polymerase identifiziert, die den Einbau von zwei L-TTP katalysiert. Diese Fähigkeit konnte auf eine Mutation im Fingerbereich des Enzyms zurückgeführt werden.
Auf diesen Ergebnissen aufbauend, sollten DNA-Polymerasen mit verbesserter Einbaufähigkeit durch gerichtete Evolution generiert werden. Dafür wurden zwei Evolutionssysteme getestet.
Subject (DDC)
540 Chemistry
Keywords
Therminator DNA-Polymerase,L-DNA,DNA Polymerase,Therminator DNA polymerase,Pfu DNA polymerase,L-TTP
Conference
Review
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Cite This
ISO 690
DETMER, Ilka, 2007. Studien zum Substratspektrum von DNA-Polymerasen [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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Examination date of dissertation
September 28, 2007