Physikalische Kartierung und Genexpressionsanalysen im Genom von Neurospora crassa
Physikalische Kartierung und Genexpressionsanalysen im Genom von Neurospora crassa
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2001
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Aign, Verena
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Physical mapping and gene expression analysis in the genome of Neurospora crassa
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Dissertation
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Abstract
The filamentous fungus Neurospora crassa has been used as a model organism in basic science for more than 50 years. In germany, a neurospora genome project started in 1998 that aims at the sequencing of the chromosomes II and V.
The physical maps described in the first part of this work formed the basis of the sequencing project. For mapping, a cosmid library with a 17-fold genomic coverage and a BAC library with a 15-fold coverage were used, from which chromosome specific sublibraries were selected. Physical mapping was done by hybridising labelled DNA of single clones to the libraries. Ordering of the clones according to their hybridisation pattern was performed with an established software package. The resulting map of chromosome II contains 13 regions, the map of chromosome V 21 regions of overlapping clones (contigs).
In the second part of the work some gene expression profiling experiments were performed using selfmade cDNA microarrays of N. crassa. By hybridising complex RNA probes transcriptional profiles were generated for three different growth conditions of mycelium of N. crassa. In each experiment, two mRNA populations were labelled by reverse transkription with two different fluorescent dyes and cohybridised to a single chip. After detection and quantification of the signal intensities, factors for induction or repression of the genes were calculated and visualised in a correspondence analysis.
The physical maps described in the first part of this work formed the basis of the sequencing project. For mapping, a cosmid library with a 17-fold genomic coverage and a BAC library with a 15-fold coverage were used, from which chromosome specific sublibraries were selected. Physical mapping was done by hybridising labelled DNA of single clones to the libraries. Ordering of the clones according to their hybridisation pattern was performed with an established software package. The resulting map of chromosome II contains 13 regions, the map of chromosome V 21 regions of overlapping clones (contigs).
In the second part of the work some gene expression profiling experiments were performed using selfmade cDNA microarrays of N. crassa. By hybridising complex RNA probes transcriptional profiles were generated for three different growth conditions of mycelium of N. crassa. In each experiment, two mRNA populations were labelled by reverse transkription with two different fluorescent dyes and cohybridised to a single chip. After detection and quantification of the signal intensities, factors for induction or repression of the genes were calculated and visualised in a correspondence analysis.
Summary in another language
Der filamentöse Ascomycet Neurospora crassa dient seit mehr als 50 Jahren als Modellorganismus vor allem für genetische Studien. Das deutsche Neurospora crassa Genom-Projekt, dass 1998 initiiert wurde, machte es sich zur Aufgabe, die Chromosomen II und V, die zusammen etwa ein Drittel der Gesamtsequenz ausmachen, zu sequenzieren.
Die im ersten Teil dieser Arbeit erstellten physikalischen Klonkarten von Chromosom II und V dienten als Basis für die Sequenzierung. Für die Kartierung wurden eine Cosmid-Bibliothek mit einer 17-fachen Abdeckung des Genoms und eine BAC-Bibliothek mit einer 15-fachen Abdeckung verwendet. Aus diesen Bibliotheken wurden zunächst Chromosomen-spezifische Sub-Bibliotheken selektiert. Ausgehend von den Sub-Bibliotheken wurde die physikalische Kartierung durch Hybridisierung durchgeführt. Die DNA einzelner Klone wurde nach Markierung auf die Membranen der Sub-Bibliotheken hybridisiert. Die Anordnung der Klone anhand ihrer Hybridisierungsmuster zu einer physikalischen Karte erfolgte mit einem Softwarepaket. Die resultierende Karte von Chromosom II besteht aus 13, die Karte von Chromosom V aus 21 Bereichen zusammenhängender Klone.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Genexpressionsanalysen mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie durchgeführt. Durch Hybridisierung komplexer RNA-Proben auf cDNA-Chips wurden die Transkriptionsprofile für drei verschiedene Wachstumsbedingungen für Mycel von N. crassa erstellt. Für den Vergleich der Genexpression wurden jeweils zwei mRNA-Populationen nach Markierung durch reverse Transkription mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen auf die Chips cohybridisiert. Nach Detektion und Quantifizierung der Signalintensitäten, die direkt mit der Häufigkeit des entsprechenden Transkripts korrelieren, wurden aus dem Verhältnis der Signalintensitäten beider Proben Faktoren für Induktion bzw. Repression der zugehörigen Gene bestimmt. Die Daten wurden mit Hilfe der Korrespondenzanalyse verglichen.
Die im ersten Teil dieser Arbeit erstellten physikalischen Klonkarten von Chromosom II und V dienten als Basis für die Sequenzierung. Für die Kartierung wurden eine Cosmid-Bibliothek mit einer 17-fachen Abdeckung des Genoms und eine BAC-Bibliothek mit einer 15-fachen Abdeckung verwendet. Aus diesen Bibliotheken wurden zunächst Chromosomen-spezifische Sub-Bibliotheken selektiert. Ausgehend von den Sub-Bibliotheken wurde die physikalische Kartierung durch Hybridisierung durchgeführt. Die DNA einzelner Klone wurde nach Markierung auf die Membranen der Sub-Bibliotheken hybridisiert. Die Anordnung der Klone anhand ihrer Hybridisierungsmuster zu einer physikalischen Karte erfolgte mit einem Softwarepaket. Die resultierende Karte von Chromosom II besteht aus 13, die Karte von Chromosom V aus 21 Bereichen zusammenhängender Klone.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Genexpressionsanalysen mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie durchgeführt. Durch Hybridisierung komplexer RNA-Proben auf cDNA-Chips wurden die Transkriptionsprofile für drei verschiedene Wachstumsbedingungen für Mycel von N. crassa erstellt. Für den Vergleich der Genexpression wurden jeweils zwei mRNA-Populationen nach Markierung durch reverse Transkription mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen auf die Chips cohybridisiert. Nach Detektion und Quantifizierung der Signalintensitäten, die direkt mit der Häufigkeit des entsprechenden Transkripts korrelieren, wurden aus dem Verhältnis der Signalintensitäten beider Proben Faktoren für Induktion bzw. Repression der zugehörigen Gene bestimmt. Die Daten wurden mit Hilfe der Korrespondenzanalyse verglichen.
Subject (DDC)
570 Biosciences, Biology
Keywords
DNA-Chip,physikalische Kartierung,Membran,Aminoallyl-dUTP,BAC-Bibliothek,microarray,physical mapping,expression profiling,linkage group
Conference
Review
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ISO 690
AIGN, Verena, 2001. Physikalische Kartierung und Genexpressionsanalysen im Genom von Neurospora crassa [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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Examination date of dissertation
February 21, 2002