DNA and RNA Polymerases with Expanded Substrate Scope : Synthesis of Modified Nucleic Acids Using Engineered Polymerases Generated by Directed Evolution

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Dissertation
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Zusammenfassung

Modified RNA is used in a series of nucleic acid-based, cutting-edge technologies such as antisense oligonucleotide, small interfering RNA (siRNA) or as aptamer. Furthermore, modifications within RNA are used for studying RNA structure and dynamics. The 2’-position of the sugar moiety is a desirable position for introducing modifications within the RNA target because modifications attached to this position provide the RNA with desired properties such as increased stability. Additionally, the 2’-position is important because it can be advantageous for introducing selenium into RNA for use in X-ray crystallographic structure determination. 2’-Methylseleno (2’-SeCH3)-modified RNA is accessible by traditional chemical synthesis, and thus limited in its available length due to the inherent limitations of the synthesis on solid support. In the present work, the enzymatic synthesis of 2’-SeCH3-modified RNA has been elaborated by using engineered variants of T7 RNA polymerase. This approach provides access to long selenium modified RNA, which cannot be accomplished by chemical synthesis. Furthermore, this research shows the effectiveness of an established fluorescence readout-based screening assay that was used to identify a variant of T7 RNA polymerase with an increased acceptance of 2’-SeCH3-NTPs by directed evolution.

First, the enzymatic synthesis of 2’-SeCH3-modified RNA was investigated by using two T7 RNA polymerase mutants known to have a high tolerance for 2’-modified NTPs. These investigations were conducted in collaboration with Prof. Dr. Ronald Micura from Innsbruck University in Austria, where his research team assisted in synthesizing the four 2’-SeCH3-NTPs. In vitro transcription reactions were performed in the presence of 2’-SeCH3-UTP or 2’-SeCH3-CTP involving the T7 RNA polymerase mutants previously reported by Sousa (Y639F, H784A)[1] and Ellington (E593G, Y639V, V685A, H784G)[2]. It was discovered that both mutants can incorporate the 2’-SeCH3-modified nucleotides into an 89-mer transcript at various positions, whereas the wildtype T7 RNA polymerase fails to do so. Both mutants possess amino acid substitutions at position Y639 and H784, two residues known to be involved in nucleotide discrimination.[3,4] Encouraged by these results, saturation mutagenesis of amino acid positions Y639 and H784 was applied to construct a library comprising of 3200 variants. This library was screened for active T7 RNA polymerase variants by using a screening assay based on fluorescence readout after transcription by using the RNA specific stain SYBR Green II. The assay was established in 384-well plates to screen mutant libraries of T7 RNA polymerase in high-throughput directly with diluted E. coli lysates containing the overexpressed variants. The screening procedure was validated by screening the first library and then used to screen a second mutant library composed of 1600 variants. The second mutant library was constructed by random mutagenesis based on the Ellington mutant (E593G, Y639V, V685A, H784G) using error-prone PCR. Active variants from both libraries were purified and tested in 32P-based transcription assays for increased incorporation efficiencies of the 2’-SeCH3-modified nucleotides. In doing so, a T7 RNA polymerase variant from the second library was identified, referred to as 2P16, that exhibits an increased acceptance for the tested 2’-SeCH3-NTPs compared to the parental mutant from which it derived. DNA sequencing revealed that this 2P16 has seven mutations in addition to the four initial ones, totalling 11 mutations that surprisingly did not affect its ability to polymerize natural NTPs. These results highlight the benefit of directed protein evolution and show that the established screening system is well-suited to identify T7 RNA polymerase variants with altered properties like the ability to incorporate 2’-modified nucleotides. Furthermore, this approach resulted in the identification of a T7 RNA polymerase mutant that can further be used for the efficient enzymatic synthesis of 2’-SeCH3-modified RNA for application in X-ray crystallography.

The second part of this work focuses on the enzymatic synthesis of four unnatural nucleic acid polymers comprising of CeNA, HNA, ANA and dXNA (cyclohexenyl nucleic acid, 1,5-anhydrohexitol nucleic acid, arabino nucleic acid and deoxyxylo nucleic acid). The investigation used a selection of DNA polymerases and mutants of eukaryotic, prokaryotic, and archaic origin representing different polymerase families. Over the past two decades, the scientific community has intensively studied the chemical and enzymatic synthesis, the reverse transcription and structural characteristics of synthetic genetic polymers, also referred to as xeno-nucleic acids (XNA). This research was originally driven by the question of how life evolved on earth and why DNA and RNA were naturally selected over other possible information storage systems. In this context, it was investigated in the present work whether DNA polymerase mutants with broadened substrate spectra, which had either been generated by site-directed mutagenesis or by directed protein evolution, are able to synthesize the unnatural nucleic acids in a DNA-dependent manner. Homopolymer formation of the four different sugar-modified XNAs was examined in 32P-based primer extension assays in order to identify DNA polymerases that show potential to polymerize the respective modified nucleotides. In addition to testing 2’-deoxyxyloadenosine 5’-triphosphate (dXATP), four sugar modified thymidine 5’-triphosphates were also tested: hTTP, araTTP, ceTTP and dXTTP. The investigations revealed that family-B polymerases and mutants were able to efficiently incorporate arabino, cyclohexenyl and hexitol nucleotides into a growing XNA strand, whereas family-A polymerases had significant problems with the sugar-modified nucleotides. Furthermore, it was observed that the tested DNA polymerase mutants showed increased incorporation behaviours of the nucleotide analogues compared to their respective wildtype polymerase. These results are promising and indicate that family-B polymerases might be well-suited to evolve into DNA-dependent XNA polymerases. The investigations on the DNA-dependent enzymatic synthesis of deoxyxylose nucleic acids (dXNA) have revealed that dXATP and dXTTP are poor substrates for all of the tested DNA polymerases irrespective of their original polymerase family. These observations are consistent with the proposed orthogonality of dXNA. Nevertheless, a mutant of human DNA polymerase beta was observed to efficiently incorporate and elongate the tested deoxyxylose nucleotides and might therefore be an interesting candidate to develop into a DNA-dependent dXNA polymerase using directed protein evolution.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Modifizierte RNA findet Anwendung in einer Reihe von Nukleinsäure-basierten Spitzentechnologien wie als Antisense Oligonukleotid, small interfering RNA (siRNA) und als Aptamer. Außerdem werden RNA Modifikationen bei Methoden zur Strukturaufklärung und zur Beobachtung der RNA-Dynamik verwendet. Die 2’-Position der Zuckereinheit ist eine beliebte Position um Modifikationen in eine RNA Zielsequenz einzubringen, da Modifikationen an dieser Position der RNA gewünschte Eigenschaften wie eine erhöhte Stabilität verleihen. Zusätzlich hat sich die 2’-Position als vorteilhaft für das Einbringen von Selen in RNA zur Anwendung in der Röntgenstrukturanalyse erwiesen. 2’-Selenomethyl (2’-SeCH3)-modifizierte RNA ist bislang nur über chemische Synthese zugänglich und aus diesem Grund in der verfügbaren Länge begrenzt, da die Festphasensynthese diese methodenbedingte Limitierung mit sich bringt. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Synthese von 2’-SeCH3-modifizierter RNA unter Verwendung von veränderten Varianten der T7 RNA-Polymerase erarbeitet. Diese Annäherung eröffnet den Zugang zu längeren Selen-modifizierten RNA Molekülen, die nicht über chemische Synthese hergestellt werden können. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit die Wirksamkeit eines Fluoreszenz-basierten Durchmusterungsassays gezeigt werden, der dazu benutzt wurde eine T7 RNA-Polymerase Variante mit erhöhter Akzeptanz für 2’-SeCH3-NTPs über gerichtete Evolution zu identifizieren.
Zunächst wurde die enzymatische Synthese von 2’-SeCH3-modifizierter RNA unter Verwendung von zwei T7 RNA-Polymerase Mutanten untersucht, die bekannt sind eine erhöhte Toleranz gegenüber 2’-modifizierten NTPs aufzuweisen. Diese Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Ronald Micura von der Universität Innsbruck in Österreich durchgeführt, in dessen Arbeitsgruppe die Synthese der vier 2’-SeCH3-NTPs erarbeitet wurde. Es wurden in vitro Transkriptionsreaktionen in der Anwesenheit von 2’-SeCH3-UTP oder 2’-SeCH3-CTP mit T7 RNA-Polymerase Mutanten durchgeführt, die zuvor von Sousa (Y639F, H784A)[1] und Ellington (Y639V, H784G, E593G, V685A)[2] beschrieben wurden. Es wurde festgestellt, dass beide Mutanten in der Lage waren die 2’-SeCH3-modifizierten Nukleotide in ein 89 Nukleotide langes Transkript an mehreren verschiedenen Positionen einzubauen, wohingegen die Wildtyp T7 RNA-Polymerase nicht dazu in der Lage war. Ermutigt von diesen Ergebnissen wurde daraufhin eine Mutantenbibliothek durch Sättigungsmutagenese an den beiden Aminosäurepositionen Y639 und H784 erstellt, die 3200 Varianten umfasste. Die Bibliothek wurde nach aktiven T7 RNA-Polymerase Varianten durchmustert indem ein Durchmusterungsassay verwendet wurde, der auf dem Auslesen von Fluoreszenz mit Hilfe des RNA-spezifischen Farbstoffs SYBR Green II nach der Transkription basiert. Dieser Durchmusterungsassay wurde in 384-Lochplatten entwickelt, um Mutantenbibliotheken der T7 RNA-Polymerase im Hochdurchsatz unter direkter Verwendung von verdünnten E. coli Lysaten zu durchmustern, die die überexprimierten Varianten enthielten. Der Durchmusterungsprozess wurde bei der Durchmusterung der ersten Bibliothek validiert und im Anschluss dazu genutzt eine zweite Mutantenbibliothek zu durchmustern, die aus 1600 Varianten bestand. Diese zweite Mutantenbibliothek wurde über randomisierte Mutagenese ausgehen von der Ellington Vierfachmutante über fehleranfällige PCR (error-prone PCR) hergestellt. Aktive Varianten aus beiden Bibliotheken wurden aufgereinigt und in 32P-basierten Transkriptionsassays auf erhöhte Einbaueffizienzen von 2’-SeCH3-modifizierten Nukleotiden untersucht. Auf diese Weise konnte eine T7 RNA-Polymerase Variante aus der zweiten Bibliothek identifiziert werden, die eine erhöhte Akzeptanz der untersuchten 2’-SeCH3-NTPs im Vergleich zur Ausgangsmutante aufweist und die im Folgenden als 2P16 bezeichnet wurde. Die Sequenzierung des Gens dieser Mutante brachte zum Vorschein, dass diese zusätzlich noch sieben weitere Mutationen zu den vier anfänglichen Mutationen aufweist und diese 11 Mutationen erstaunlicherweise nicht ihre Fähigkeit beeinflussen natürliche NTPs zu polymerisieren. Diese Ergebnisse demonstrieren ein weiteres Mal die Leistungsfähigkeit von gerichteter Protein Evolution Enzyme mit gewünschten Eigenschaften zu generieren. Außerdem konnte gezeigt werden, dass das etablierte Durchmusterungssystem gut dafür geeignet ist um T7 RNA-Polymerase Varianten mit veränderten Eigenschaften, wie die Fähigkeit zum Einbau von 2’-modifizierten Nukleotiden, zu identifizieren. Hinzu kommt, dass dieses Vorgehen zur Identifizierung einer T7 RNA-Polymerase Variante führte, die für die effiziente enzymatische Synthese von 2’-SeCH3-modifizierter RNA für die Anwendung in der Röntgenstrukturanalyse verwendet werden kann.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die enzymatische Synthese von vier unnatürlichen Nukleinsäurepolymeren, einschließlich CeNA, HNA, ANA und dXNA (cyclohexenyl nucleic acid, 1,5-anhydrohexitol nucleic acid, arabino nucleic acid und deoxyxylo nucleic acid) untersucht. Die Untersuchungen wurden unter Verwendung von einer Auswahl an DNA-Polymerasen und Mutanten eukaryotischen, prokaryotischen und archaeischen Ursprungs aus verschiedenen Polymerase Familien durchgeführt. Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurde die chemische und enzymatische Synthese, die reverse Transkription und die strukturellen Eigenschaften von synthetischen genetischen Polymeren, die auch als Xeno-Nukleinsäuren (XNAs) bezeichnet werden, intensiv von der Wissenschaft untersucht. Die Studien sollen dazu beitragen das allgemeine Wissen bezüglich der Entstehung von Leben auf der Erde und der natürlichen Auswahl von DNA und RNA gegenüber anderen Informationssystemen zur Speicherung der Erbinformation zu erweitern. In diesem Zusammenhang wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob DNA-Polymerase Mutanten mit erweitertem Substratspektrum, die entweder über ortsgerichtete Mutagenese oder über gerichtete Protein Evolution hergestellt wurden, in der Lage sind die unnatürlichen Nukleinsäuren in einer DNA-abhängigen Art und Weise zu synthetisieren. Es wurde dabei die Homopolymerbildung der vier verschiedenen zuckermodifizierten XNAs in 32P-basierenden Primerverlängerungsreaktionen untersucht, um nach Möglichkeit DNA-Polymerasen zu identifizieren, die ein Potenzial zur Polymerisierung der modifizierten Nukleotide aufweisen. Zusätzlich zu 2’-Deoxyxyloadenosin 5’-Triphosphat (dXATP) wurden ebenfalls vier zuckermodifizierte Thymidin Triphosphate getestet: hTTP, araTTP, ceTTP und dXTTP. Die Untersuchungen ergaben, dass B-Familie Polymerasen und Mutanten in der Lage waren arabino-, cyclohexenyl- und hexitol-modifizierte Nukleotide effizient in einen wachsenden XNA Strang einzubauen, wohingegen Polymerasen der A-Familie erhebliche Probleme mit den zuckermodifizierten Nukleotiden hatten. Es konnte außerdem beobachtet werden, dass die untersuchten DNA-Polymerase Mutanten ein besseres Einbauverhalten der Nukleotid-Analoga aufwiesen als die jeweils zugehörige Wildtyp-Polymerase. Diese Ergebnisse sind vielversprechend und zeigen, dass B-Familie Polymerasen gut dafür geeignet wären um aus ihnen DNA-abhängige XNA-Polymerasen zu erzeugen. Die Untersuchungen bezüglich der DNA-abhängigen enzymatischen Synthese von Deoxyxylose Nukleinsäuren (dXNA) haben gezeigt, dass dXATP and dXTTP schlechte Substrate für alle getesteten DNA-Polymerasen sind, unabhängig davon welcher Polymerasen Familie sie angehören. Diese Beobachtungen sind übereinstimmend mit der vermuteten Orthogonalität von dXNA. Es konnte dennoch beobachtet werden, dass eine Mutante der humanen DNA-Polymerase beta die getesteten Deoxyxylose-Nukleotide effizient einbauen und verlängern konnte und daher ein interessantes Ausgangsenzym darstellt, um über gerichtete Protein Evolution eine DNA-abhängige dXNA-Polymerase zu entwickeln.

Fachgebiet (DDC)
540 Chemie
Schlagwörter
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690SIEGMUND, Vanessa, 2013. DNA and RNA Polymerases with Expanded Substrate Scope : Synthesis of Modified Nucleic Acids Using Engineered Polymerases Generated by Directed Evolution [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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The assay was established in 384-well plates to screen mutant libraries of T7 RNA polymerase in high-throughput directly with diluted E. coli lysates containing the overexpressed variants. The screening procedure was validated by screening the first library and then used to screen a second mutant library composed of 1600 variants. The second mutant library was constructed by random mutagenesis based on the Ellington mutant (E593G, Y639V, V685A, H784G) using error-prone PCR. Active variants from both libraries were purified and tested in 32P-based transcription assays for increased incorporation efficiencies of the 2’-SeCH3-modified nucleotides. In doing so, a T7 RNA polymerase variant from the second library was identified, referred to as 2P16, that exhibits an increased acceptance for the tested 2’-SeCH3-NTPs compared to the parental mutant from which it derived. DNA sequencing revealed that this 2P16 has seven mutations in addition to the four initial ones, totalling 11 mutations that surprisingly did not affect its ability to polymerize natural NTPs. These results highlight the benefit of directed protein evolution and show that the established screening system is well-suited to identify T7 RNA polymerase variants with altered properties like the ability to incorporate 2’-modified nucleotides. Furthermore, this approach resulted in the identification of a T7 RNA polymerase mutant that can further be used for the efficient enzymatic synthesis of 2’-SeCH3-modified RNA for application in X-ray crystallography.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;The second part of this work focuses on the enzymatic synthesis of four unnatural nucleic acid polymers comprising of CeNA, HNA, ANA and dXNA (cyclohexenyl nucleic acid, 1,5-anhydrohexitol nucleic acid, arabino nucleic acid and deoxyxylo nucleic acid). The investigation used a selection of DNA polymerases and mutants of eukaryotic, prokaryotic, and archaic origin representing different polymerase families. Over the past two decades, the scientific community has intensively studied the chemical and enzymatic synthesis, the reverse transcription and structural characteristics of synthetic genetic polymers, also referred to as xeno-nucleic acids (XNA). This research was originally driven by the question of how life evolved on earth and why DNA and RNA were naturally selected over other possible information storage systems. In this context, it was investigated in the present work whether DNA polymerase mutants with broadened substrate spectra, which had either been generated by site-directed mutagenesis or by directed protein evolution, are able to synthesize the unnatural nucleic acids in a DNA-dependent manner. 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May 24, 2013
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