Internalization and intracellular trafficking of plasmid DNA delivered by electroporation in vitro

Lade...
Vorschaubild
Dateien
Rosazza_286298.pdf
Rosazza_286298.pdfGröße: 9.36 MBDownloads: 845
Datum
2014
Herausgeber:innen
Kontakt
ISSN der Zeitschrift
Electronic ISSN
ISBN
Bibliografische Daten
Verlag
Schriftenreihe
Auflagebezeichnung
DOI (zitierfähiger Link)
ArXiv-ID
Internationale Patentnummer
Angaben zur Forschungsförderung
Projekt
Open Access-Veröffentlichung
Open Access Green
Sammlungen
Core Facility der Universität Konstanz
Gesperrt bis
Titel in einer weiteren Sprache
Internalisation et trafic intracellulaire de l'ADN plasmidique délivré par electroporation in vitro
Forschungsvorhaben
Organisationseinheiten
Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
Published
Erschienen in
Zusammenfassung

Elektroporation ist eine Methode um Moleküle (von kleinen chemischen Wirkstoffen bis Plasmid-DNA) in Zellen oder Gewebe einzuschleußen. Das Prinzip beruht auf der Applikation kurzer (µs-ms) aber intensiver Spannungspulse (100-1000V), die die Durchlässigkeit der Plasmamembran modulieren. Für kleine Moleküle erfolgt der Transfer durch mutmaßlich induzierte Poren, wohingegen die Aufnahme von Plasmid-DNA komplexerer Natur ist und Aufklärung bedarf. Während der elektrischen Pulse wird die Zellmembran durchlässig und die DNA wird elektrophoretisch gegen diese gedrückt, wo sie dann während ca. 10 Min als diskretes Cluster in diese aufgenommen wird. Nach den elektrischen Pulsen wird die DNA aufgenommen, wandert durch das Zytoplasma bis diese den Zellkern erreicht, wo schließlich DNA Expression initiiert wird. Der Fokus dieser Arbeit war vorwiegend auf die Aufnahme und den intrazellulären Transport von DNA gerichtet, da es noch Aufklärung bedarf, wie diese Prozesse im Falle der Elektroporation ablaufen. Die relevanten Zellstrukturen, die zu diesen Prozessen beitragen könnten, sind der Endozytose-Apparat gefolgt vom endosomaler Bewegung und das Zytoskelett das aus Actin-Filamenten und Mikrotubuli besteht. Die durchgeführten Untersuchungen beruhten hauptsächlich auf verschiedenen Fluoreszenzmikroskopie-Techniken und Durchfluss-Zytometrie.


Die Aufnahme von DNA scheint vorwiegend über Endozytose zu erfolgen. Der Einsatz verschiedener, pharmakologischer Endozytose-Hemmer (MCD, CPZ, MDC, Gen, Fil, Wort, EIPA, Lat, Jas), in Kombination mit fluoreszenzmarkierten Endozytose-Markern (TF, CTB, Dextran (70 kDa), Actin) ließ uns schlussfolgern, dass Endozytose über Clathrin und Lipid Rafts vermittelt wird und des Weiteren durch Makropinozytose erfolgt, deren relative Anteile 25%, 50% und 30% entsprechen. Das bedeutet, dass Endocytose vermutlich der dominierende (wenn nicht der einzige) Weg ist, über den DNA-Aggregate in die Zelle gelangen. Es müssen weitere Anstrengungen unternommen werden, um den Internalisierung-Mechanismus gänzlich aufzuklären. Darüber hinaus bietet allein die Lipidraft-vermittelte Endozytose eine Vielzahl von Möglichkeiten (caveolin, flotillin, GEEC, etc.), die diskutiert werden sollten. Diese Ergebnisse stimmen mit der räumlichen und zeitlichen Verteilung der DNA-Aggregate an der Zellmembran überein (mehrere Hundert Nanometer große Aggregate, die während mehrerer Minuten bestehen bleiben und nicht vom extrazellulären medium zugänglich sind).


Nach deren Aufnahme in die Zelle, scheint die DNA dem klassischen intrazellulären Transportmechanismus zu folgen. Dynamische Kolokalisations-Experimente in Zellen, die verschiedene endosomale Marker (Rab5, Rab11, Rab9 und Lamp1) exprimieren, zeigen uns, dass während der ersten Stunde nach Elektrotransfer der DNA, diese zu 70% in frühen, zu 50% in rezyklierenden und zu 30% in späten Endosomen vorliegt. Ein bis zwei Stunden nach Verabreichung befinden sich 60% der DNA in Lamp1-Strukturen, höchstwahrscheinlich in Lysosomen. Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung überein, dass sich die DNA geclustert im Zytolasma befindet und bekräftigen den bereits erwähnten Endocytose-Mechanismus.
Im Zytoplasma wird DNA aktiv sowohl über Aktin-Filamente als auch über Mikrotubuli transportiert.

Der Einsatz von pharamokologischen Inhibitoren (Lat, Jas, Noc, Tax), in Kombination mit Einzel-Partikel-Verfolgung (SPT), die für eine große Anzahl von DNA-Aggregaten durchgeführt wurde, zeigen zweifelsfrei, dass das Zytoskelett essentiell für den intrazellulären Transport ist. Die DNA zeigt die typische Bewegung bestehend aus intermittierenden Phasen aktiven Transports, wie es auch für Endsomen oder andere intrazelluläre Frachtgüter beobachtet wird. Phasen aktiven Transports zeigen im Mittel Geschwindigkeiten von 250 nm/s, Dauer von 6 s, und zurückgelegte Distanzen von 1.3 µm. Die erhaltenen Verteilungen dieser Parameter sind jedoch äußerst breit mit Geschwindigkeiten zwischen 50 nm/s und 3400 nm/s, zurückgelegten Distanzen von 0.1 µm bis 12 µm, und Persistenzen die sich von 2 s bis 30 s erstrecken. Diese Ergebnisse bestätigen frühere Arbeiten, welche auf die Rolle der Mikrotubuli als Transportmittel für DNA in Zellen hindeuten. Des Weiteren bestätigt dies, dass sich die DNA in Endosomen befindet, da deren Membran über Proteine (vermutlich Rabs) verfügt, die eine Bindung an molekulare Motoren ermöglichen. Dies erklärt außerdem, wie derart große DNA-Aggregate zielgerichtet durch das dichtstrukturierte Zytoplasma wandern können, da es ansonsten unmöglich scheint den Zellkern allein über Diffusion zu erreichen.


Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich nach erfolgter Elektroporation, die Reise der DNA von der Plasma-Membran zur Kernhülle durchaus mit derer, die man für virale und nicht-virale Transfektionsmethoden beobachtet, vergleichen lässt. Die beschriebenen Transportwege scheinen effektiv zu sein, da die Störung bestimmter Schritte in einer verminderten Genexpression resultiert. Obgleich unsere Beobachtungen bestätigt und genauer untersucht werden müssen, wäre der nächste Schritt den mutmaßlichen endosomalen Austritt zu untersuchen, der essentiell für eine erfolgreiche Genexpression ist.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

L’électroporation est une méthode physique de délivrance de molécules (allant des petits agents chimiques aux gros ADN plasmidiques) dans les cellules ou tissus. L’application d’impulsions électriques courtes (µs-ms) mais intenses (100-1000 V) module la perméabilité membranaire. Le transfert des petites molécules se déroule vraisemblablement par diffusion à travers de présumés electropores alors que le transfert d’ADN plasmidique est plus compliqué et reste à élucider. Lors de l’application des impulsions électriques, la membrane devient perméable et l’ADN est électrophorétiquement poussé vers celle-ci où il est inséré en agrégats distincts pendant une dizaine de minutes. Apres les impulsions électriques, l’ADN est internalisé, il navigue à travers le cytoplasme jusqu’à atteindre le noyau où l’expression de l’ADN est initié. Mon travail de thèse se concentre essentiellement sur l’internalisation et le trafic intracellulaire de l’ADN, deux étapes qui sont assez peu décrites dans le cadre de l’électroporation. Les structures cellulaires pertinentes qui pourraient participer à ces étapes sont la machine endocytique suivie par le trafic endosomal et le cytosquelette (microfilaments d’actine et microtubules). Le travail de recherche repose principalement sur des techniques de microscopie de fluorescence et de cytométrie de flux.


L’internalisation de l’ADN semble se faire majoritairement par endocytose. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques de l’endocytose (MCD, CPZ, MDC, Gen, Fil, Wort, EIPA, Lat, Jas) et de marqueurs fluorescents d’endocytose (TF, CTB, dextran 70 kDa, actine) permet de conclure que l’endocytose médiée par la clathrine et les rafts lipidiques ainsi que la macropinocytose sont impliquées, dans des proportions estimées pour être 25%, 50% et 30% respectivement. L’endocytose semble être la principale (sinon la seule) voie par laquelle les agrégats d’ADN entrent dans les cellules. De plus amples recherches doivent être menées pour dépeindre précisément le mécanisme d’internalisation de l’ADN d’autant plus que l’endocytose médiée par les rafts lipidiques représente un large panel de possibilités (caveoline, flotilline, GEEC…) qui méritent d’être décrites. Nos résultats sont en accord avec la distribution spatiotemporelle de l’ADN observée à la membrane (agrégats de quelques centaines de nanomètres persistant pendant quelques minutes et inaccessible à partir du milieu extracellulaire).


Une fois dans le cytoplasme, l’ADN semble suivre le trafic endo-lysosomal classique. La colocalization en dynamique effectuée sur des cellules exprimant séparément plusieurs marqueurs d’endosomes (Rab5, Rab11, Rab9 et Lamp1) démontre que l’ADN est présent dans les endosomes précoces, tardifs et de recyclages dans des proportions calculées pour être 70%, 50% et 30% respectivement, valeurs moyennées sur l’heure qui suit l’électrotransfer de l’ADN. Entre 1-2 h après la délivrance, 60% de l’ADN est situé dans des structures marquées Lamp1 avec une prédominance probable des lysosomes. Ces résultats sont en accord avec l’observation de l’ADN toujours présent en agrégats dans le cytoplasme et ils renforcent l’observation d’un mécanisme d’endocytose mentionné précédemment.


L’ADN dans le cytoplasme est transporté activement par les microfilaments d’actine et les microtubules. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques (Lat, Jas, Noc, Tax) combiné au suivi de particules uniques effectué sur un très grand nombre d’agrégats d’ADN clairement démontre que le cytosquelette contrôle la migration de l’ADN dans le cytoplasme. L’ADN exhibe le mouvement typique des endosomes ou autres cargos avec des phases intermittentes de transport actif et de diffusion. Dans nos conditions expérimentales, les phases de transport actif ont en moyenne une vitesse de 250 nm/s, une persistance de 6 s et engendre un déplacement de 1,3 µm. Cependant, les distributions de ces paramètres sont larges avec des vitesses allant de 50 nm/s à 3400 nm/s, des déplacements de 0,1 µm à 12 µm et des durées de 2 s à 30 s. Ces résultats confirment des travaux précédemment publiés qui présentent les microtubules comme un moyen de migration de l’ADN dans les cellules. Cela est aussi en accord avec la présence de l’ADN dans des endosomes vu que leurs membranes contiennent des protéines (probablement Rabs) capables de se lier aux moteurs moléculaires. De plus, cela explique comment les gros agrégats d’ADN peuvent traverser le cytoplasme dense et atteindre avec succès le noyau, phénomène improbable par simple diffusion.
Pour conclure, le parcours de l’ADN de la membrane plasmique à l’enveloppe nucléaire est, après electroporation, très similaire à celui observé dans le cadre d’autres méthodes de délivrance, viral ou non virales. Le chemin de l’ADN que nous décrivons est efficace étant donné que la perturbation d’une étape intermédiaire entraine une réduction de l’expression génique. Bien que nos découvertes doivent être confirmées et nécessitent de plus amples investigations, la prochaine étape clé à comprendre est l'échappement supposé de l'endosome qui doit forcement se réaliser afin obtenir une expression de l’ADN.

Fachgebiet (DDC)
540 Chemie
Schlagwörter
Einzelpartikelverfolgung, Endosome
Konferenz
Rezension
undefined / . - undefined, undefined
Zitieren
ISO 690ROSAZZA, Christelle, 2014. Internalization and intracellular trafficking of plasmid DNA delivered by electroporation in vitro [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
BibTex
@phdthesis{Rosazza2014Inter-28629,
  year={2014},
  title={Internalization and intracellular trafficking of plasmid DNA delivered by electroporation in vitro},
  author={Rosazza, Christelle},
  address={Konstanz},
  school={Universität Konstanz}
}
RDF
<rdf:RDF
    xmlns:dcterms="http://purl.org/dc/terms/"
    xmlns:dc="http://purl.org/dc/elements/1.1/"
    xmlns:rdf="http://www.w3.org/1999/02/22-rdf-syntax-ns#"
    xmlns:bibo="http://purl.org/ontology/bibo/"
    xmlns:dspace="http://digital-repositories.org/ontologies/dspace/0.1.0#"
    xmlns:foaf="http://xmlns.com/foaf/0.1/"
    xmlns:void="http://rdfs.org/ns/void#"
    xmlns:xsd="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#" > 
  <rdf:Description rdf:about="https://kops.uni-konstanz.de/server/rdf/resource/123456789/28629">
    <dcterms:title>Internalization and intracellular trafficking of plasmid DNA delivered by electroporation in vitro</dcterms:title>
    <bibo:uri rdf:resource="http://kops.uni-konstanz.de/handle/123456789/28629"/>
    <dcterms:isPartOf rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/server/rdf/resource/123456789/29"/>
    <dspace:hasBitstream rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/bitstream/123456789/28629/1/Rosazza_286298.pdf"/>
    <void:sparqlEndpoint rdf:resource="http://localhost/fuseki/dspace/sparql"/>
    <dc:rights>terms-of-use</dc:rights>
    <dc:creator>Rosazza, Christelle</dc:creator>
    <dcterms:abstract xml:lang="deu">Elektroporation ist eine Methode um Moleküle (von  kleinen chemischen Wirkstoffen bis Plasmid-DNA) in Zellen oder Gewebe einzuschleußen. Das Prinzip beruht auf der Applikation kurzer (µs-ms) aber intensiver Spannungspulse (100-1000V), die die Durchlässigkeit der Plasmamembran modulieren. Für kleine Moleküle erfolgt der Transfer durch mutmaßlich induzierte Poren, wohingegen die Aufnahme von Plasmid-DNA komplexerer Natur ist und Aufklärung bedarf. Während der elektrischen Pulse wird die Zellmembran  durchlässig und die DNA wird elektrophoretisch gegen diese gedrückt, wo sie dann während ca. 10 Min als diskretes Cluster in diese aufgenommen wird. Nach den elektrischen Pulsen wird die DNA aufgenommen, wandert durch das Zytoplasma bis diese den Zellkern erreicht, wo schließlich DNA Expression initiiert wird. Der Fokus dieser Arbeit war vorwiegend auf die Aufnahme und den intrazellulären Transport von DNA gerichtet, da es noch Aufklärung bedarf, wie diese Prozesse im Falle der Elektroporation ablaufen. Die relevanten Zellstrukturen, die zu diesen Prozessen beitragen könnten, sind der Endozytose-Apparat gefolgt vom endosomaler Bewegung und das Zytoskelett das aus Actin-Filamenten und Mikrotubuli besteht. Die durchgeführten Untersuchungen beruhten hauptsächlich auf verschiedenen Fluoreszenzmikroskopie-Techniken und Durchfluss-Zytometrie.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;Die Aufnahme von DNA scheint vorwiegend über Endozytose zu erfolgen. Der Einsatz verschiedener, pharmakologischer Endozytose-Hemmer (MCD, CPZ, MDC, Gen, Fil, Wort, EIPA, Lat, Jas), in Kombination mit fluoreszenzmarkierten Endozytose-Markern (TF, CTB, Dextran (70 kDa), Actin) ließ uns schlussfolgern, dass Endozytose über Clathrin und Lipid Rafts vermittelt wird  und des Weiteren durch Makropinozytose erfolgt, deren relative Anteile 25%, 50% und 30% entsprechen. Das bedeutet, dass Endocytose vermutlich der dominierende (wenn nicht der einzige) Weg ist, über den DNA-Aggregate in die Zelle gelangen. Es müssen weitere Anstrengungen unternommen werden, um den Internalisierung-Mechanismus gänzlich aufzuklären. Darüber hinaus bietet allein die Lipidraft-vermittelte Endozytose eine Vielzahl von Möglichkeiten (caveolin, flotillin, GEEC, etc.), die diskutiert werden sollten. Diese Ergebnisse stimmen mit der räumlichen und zeitlichen Verteilung der DNA-Aggregate an der Zellmembran überein (mehrere Hundert Nanometer große Aggregate, die während mehrerer Minuten bestehen bleiben und nicht vom extrazellulären medium zugänglich sind).&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;Nach deren Aufnahme in die Zelle, scheint die DNA dem klassischen intrazellulären Transportmechanismus zu folgen. Dynamische Kolokalisations-Experimente in Zellen, die verschiedene endosomale Marker (Rab5, Rab11, Rab9 und Lamp1) exprimieren,  zeigen uns, dass während der ersten Stunde nach Elektrotransfer der DNA, diese zu 70% in frühen, zu 50% in rezyklierenden und zu 30% in späten Endosomen vorliegt. Ein bis zwei Stunden nach Verabreichung befinden sich 60% der DNA in Lamp1-Strukturen, höchstwahrscheinlich in Lysosomen. Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung überein, dass sich die DNA geclustert im Zytolasma befindet und bekräftigen den bereits erwähnten Endocytose-Mechanismus.&lt;br /&gt;Im Zytoplasma wird DNA aktiv sowohl über Aktin-Filamente als auch über Mikrotubuli transportiert.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;Der Einsatz von pharamokologischen Inhibitoren (Lat, Jas, Noc, Tax), in Kombination mit Einzel-Partikel-Verfolgung (SPT), die für eine große Anzahl von DNA-Aggregaten durchgeführt wurde, zeigen zweifelsfrei, dass das Zytoskelett essentiell für den intrazellulären Transport ist. Die DNA zeigt die typische Bewegung bestehend aus  intermittierenden Phasen aktiven Transports, wie es auch für Endsomen oder andere intrazelluläre Frachtgüter beobachtet wird. Phasen aktiven Transports zeigen im Mittel Geschwindigkeiten von 250 nm/s, Dauer von 6 s, und zurückgelegte Distanzen von 1.3 µm. Die erhaltenen Verteilungen dieser Parameter sind jedoch äußerst breit mit Geschwindigkeiten zwischen 50 nm/s und 3400 nm/s, zurückgelegten Distanzen von 0.1 µm bis 12 µm, und Persistenzen die sich von 2 s bis 30 s erstrecken. Diese Ergebnisse bestätigen frühere Arbeiten, welche auf die Rolle der Mikrotubuli als Transportmittel für DNA in Zellen hindeuten. Des Weiteren bestätigt dies, dass sich die DNA in Endosomen befindet, da deren Membran über Proteine (vermutlich Rabs) verfügt, die eine Bindung an molekulare Motoren ermöglichen. Dies erklärt außerdem, wie derart große DNA-Aggregate zielgerichtet durch das dichtstrukturierte Zytoplasma wandern können, da es ansonsten unmöglich scheint den Zellkern allein über Diffusion zu erreichen.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich nach erfolgter Elektroporation, die Reise der DNA von der Plasma-Membran zur Kernhülle durchaus mit derer, die man für virale und nicht-virale Transfektionsmethoden beobachtet, vergleichen lässt. Die beschriebenen Transportwege scheinen effektiv zu sein, da die Störung bestimmter Schritte in einer verminderten Genexpression resultiert. Obgleich unsere Beobachtungen bestätigt und genauer untersucht werden müssen, wäre der nächste Schritt den mutmaßlichen endosomalen Austritt zu untersuchen, der essentiell für eine erfolgreiche Genexpression ist.</dcterms:abstract>
    <dspace:isPartOfCollection rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/server/rdf/resource/123456789/29"/>
    <dcterms:rights rdf:resource="https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/"/>
    <dcterms:hasPart rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/bitstream/123456789/28629/1/Rosazza_286298.pdf"/>
    <foaf:homepage rdf:resource="http://localhost:8080/"/>
    <dc:date rdf:datatype="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#dateTime">2014-08-05T07:01:19Z</dc:date>
    <dc:contributor>Rosazza, Christelle</dc:contributor>
    <dcterms:issued>2014</dcterms:issued>
    <dc:language>deu</dc:language>
    <dcterms:alternative>Internalisation et trafic intracellulaire de l'ADN plasmidique délivré par electroporation in vitro</dcterms:alternative>
  </rdf:Description>
</rdf:RDF>
Interner Vermerk
xmlui.Submission.submit.DescribeStep.inputForms.label.kops_note_fromSubmitter
Kontakt
URL der Originalveröffentl.
Prüfdatum der URL
Prüfungsdatum der Dissertation
May 28, 2014
Finanzierungsart
Kommentar zur Publikation
Allianzlizenz
Corresponding Authors der Uni Konstanz vorhanden
Internationale Co-Autor:innen
Universitätsbibliographie
Begutachtet
Diese Publikation teilen