Internalization and intracellular trafficking of plasmid DNA delivered by electroporation in vitro

Abstract

Elektroporation ist eine Methode um Moleküle (von kleinen chemischen Wirkstoffen bis Plasmid-DNA) in Zellen oder Gewebe einzuschleußen. Das Prinzip beruht auf der Applikation kurzer (µs-ms) aber intensiver Spannungspulse (100-1000V), die die Durchlässigkeit der Plasmamembran modulieren. Für kleine Moleküle erfolgt der Transfer durch mutmaßlich induzierte Poren, wohingegen die Aufnahme von Plasmid-DNA komplexerer Natur ist und Aufklärung bedarf. Während der elektrischen Pulse wird die Zellmembran durchlässig und die DNA wird elektrophoretisch gegen diese gedrückt, wo sie dann während ca. 10 Min als diskretes Cluster in diese aufgenommen wird. Nach den elektrischen Pulsen wird die DNA aufgenommen, wandert durch das Zytoplasma bis diese den Zellkern erreicht, wo schließlich DNA Expression initiiert wird. Der Fokus dieser Arbeit war vorwiegend auf die Aufnahme und den intrazellulären Transport von DNA gerichtet, da es noch Aufklärung bedarf, wie diese Prozesse im Falle der Elektroporation ablaufen. Die relevanten Zellstrukturen, die zu diesen Prozessen beitragen könnten, sind der Endozytose-Apparat gefolgt vom endosomaler Bewegung und das Zytoskelett das aus Actin-Filamenten und Mikrotubuli besteht. Die durchgeführten Untersuchungen beruhten hauptsächlich auf verschiedenen Fluoreszenzmikroskopie-Techniken und Durchfluss-Zytometrie.Die Aufnahme von DNA scheint vorwiegend über Endozytose zu erfolgen. Der Einsatz verschiedener, pharmakologischer Endozytose-Hemmer (MCD, CPZ, MDC, Gen, Fil, Wort, EIPA, Lat, Jas), in Kombination mit fluoreszenzmarkierten Endozytose-Markern (TF, CTB, Dextran (70 kDa), Actin) ließ uns schlussfolgern, dass Endozytose über Clathrin und Lipid Rafts vermittelt wird und des Weiteren durch Makropinozytose erfolgt, deren relative Anteile 25%, 50% und 30% entsprechen. Das bedeutet, dass Endocytose vermutlich der dominierende (wenn nicht der einzige) Weg ist, über den DNA-Aggregate in die Zelle gelangen. Es müssen weitere Anstrengungen unternommen werden, um den Internalisierung-Mechanismus gänzlich aufzuklären. Darüber hinaus bietet allein die Lipidraft-vermittelte Endozytose eine Vielzahl von Möglichkeiten (caveolin, flotillin, GEEC, etc.), die diskutiert werden sollten. Diese Ergebnisse stimmen mit der räumlichen und zeitlichen Verteilung der DNA-Aggregate an der Zellmembran überein (mehrere Hundert Nanometer große Aggregate, die während mehrerer Minuten bestehen bleiben und nicht vom extrazellulären medium zugänglich sind).Nach deren Aufnahme in die Zelle, scheint die DNA dem klassischen intrazellulären Transportmechanismus zu folgen. Dynamische Kolokalisations-Experimente in Zellen, die verschiedene endosomale Marker (Rab5, Rab11, Rab9 und Lamp1) exprimieren, zeigen uns, dass während der ersten Stunde nach Elektrotransfer der DNA, diese zu 70% in frühen, zu 50% in rezyklierenden und zu 30% in späten Endosomen vorliegt. Ein bis zwei Stunden nach Verabreichung befinden sich 60% der DNA in Lamp1-Strukturen, höchstwahrscheinlich in Lysosomen. Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung überein, dass sich die DNA geclustert im Zytolasma befindet und bekräftigen den bereits erwähnten Endocytose-Mechanismus.Im Zytoplasma wird DNA aktiv sowohl über Aktin-Filamente als auch über Mikrotubuli transportiert.Der Einsatz von pharamokologischen Inhibitoren (Lat, Jas, Noc, Tax), in Kombination mit Einzel-Partikel-Verfolgung (SPT), die für eine große Anzahl von DNA-Aggregaten durchgeführt wurde, zeigen zweifelsfrei, dass das Zytoskelett essentiell für den intrazellulären Transport ist. Die DNA zeigt die typische Bewegung bestehend aus intermittierenden Phasen aktiven Transports, wie es auch für Endsomen oder andere intrazelluläre Frachtgüter beobachtet wird. Phasen aktiven Transports zeigen im Mittel Geschwindigkeiten von 250 nm/s, Dauer von 6 s, und zurückgelegte Distanzen von 1.3 µm. Die erhaltenen Verteilungen dieser Parameter sind jedoch äußerst breit mit Geschwindigkeiten zwischen 50 nm/s und 3400 nm/s, zurückgelegten Distanzen von 0.1 µm bis 12 µm, und Persistenzen die sich von 2 s bis 30 s erstrecken. Diese Ergebnisse bestätigen frühere Arbeiten, welche auf die Rolle der Mikrotubuli als Transportmittel für DNA in Zellen hindeuten. Des Weiteren bestätigt dies, dass sich die DNA in Endosomen befindet, da deren Membran über Proteine (vermutlich Rabs) verfügt, die eine Bindung an molekulare Motoren ermöglichen. Dies erklärt außerdem, wie derart große DNA-Aggregate zielgerichtet durch das dichtstrukturierte Zytoplasma wandern können, da es ansonsten unmöglich scheint den Zellkern allein über Diffusion zu erreichen.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich nach erfolgter Elektroporation, die Reise der DNA von der Plasma-Membran zur Kernhülle durchaus mit derer, die man für virale und nicht-virale Transfektionsmethoden beobachtet, vergleichen lässt. Die beschriebenen Transportwege scheinen effektiv zu sein, da die Störung bestimmter Schritte in einer verminderten Genexpression resultiert. Obgleich unsere Beobachtungen bestätigt und genauer untersucht werden müssen, wäre der nächste Schritt den mutmaßlichen endosomalen Austritt zu untersuchen, der essentiell für eine erfolgreiche Genexpression ist.