Gerichtete Evolution und Charakterisierung einer thermostabilen DNA-Polymerase mit erhöhter Akzeptanz für geschädigte DNA

Abstract

DNA-Polymerasen katalysieren die gesamte in der Natur vorkommende DNA-Synthese und sind die Schlüsselenzyme in zellulären Prozessen wie Replikation, Rekombination und Reparatur von DNA-Schäden. Gerade der letztere Prozess ist begleitet von einer Vielzahl verschiedener DNA-Polymerasen mit unterschiedlichsten Aufgaben während der Reparatur und erst kürzlich sind neue spezialisierte Enzyme entdeckt worden, die eine Rolle beim Überlesen von DNA-Schäden spielen und zum größten Teil unter dem Begriff der Y-Familie-Polymerasen zusammengefasst werden. Die DNA kann eine Vielzahl von DNA-Schäden erleiden, wie z.B. Hydrolyse des Phosphodiester-Rückgrates, Schädigung der Nukleobasen, Angriff durch Sauerstoffradikale, Schädigung durch UV-Licht, etc.. Diese Schäden stellen eine signifikante Barriere für replikative DNA-Polymerasen dar, können jedoch von der Zelle durch Rekrutierung spezialisierter DNA-Polymerasen repariert bzw. überlesen werden. Bis heute ist noch nicht genau geklärt, wie Zellen im Detail über solche Schäden hinweg DNA-Synthese betreiben können. Um weitere Einblicke in diese Mechanismen zu erlangen sollte ausgehend von einer DNA-Polymerase, die nicht über DNA-Schäden hinweglesen kann ein Enzym durch gerichtete Evolution entwickelt werden, dass diese Eigenschaft erfüllte. Zu diesem Zweck wurde eine N-terminal verkürzte Variante der Taq DNA-Polymerase ausgewählt (Klentaq (KTQ)), die eine große Rolle in biotechnologischen Anwendungen spielt und ein gut charakterisiertes Enzym darstellte.Durch gerichtete Evolution und Durchmusterung einer randomisierten DNA-Polymerasen-Bibliothek konnte eine Variante gefunden werden, die über DNA-Schäden hinweg lesen konnte und diese auch in einer PCR-basierten Reaktion amplifizieren konnte. Diese Variante wies nur eine einzige Aminosäure-Substitution auf. Methionin (M) 747 war zu Lysin (K) mutiert, was den Austausch einer hydrophoben zu einer kationischen Aminosäure bedeutete in räumlicher Nähe zum DNA-Templat-Strang. Diese Variante (KTQ M747K) wurde biochemisch im Vergleich zum Wildtyp Enzym charakterisiert.Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezielt die Position 747 der Klentaq DNA-Polymerase randomisiert und erneut auf einen DNA-Schaden Bypass hin untersucht. Dabei wurde gefunden, dass sich kationische Aminosäure-Substitutionen wie Lysin oder Arginin (R) positiv auf die Schaden-Bypass Eigenschaft auswirkten, anionische Aminosäure-Substitutionen wie Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D), diese verhinderten und im Allgemeinen zu einer verringerten Funktion der DNA-Polymerase führten. Da sich diese zwei Aminosäuregruppen in ihrer Ladung (kationisch anionisch) unterscheiden und in direkter Nähe zum anionisch geladenen DNA-Substrat befanden, wurde vermutet, dass die erhaltenen Effekte durch elektrostatische Wechselwirkungen bedingt waren. Diese Vermutung wurde in weiteren Experimenten bestätigt.Im dritten Teil der Dissertation wurden die Varianten KTQ M747K und KTQ M747R mit einer bereits literaturbeschriebenen Variante der Taq DNA-Polymerase (Taq I614K) kombiniert. Es standen neben dem Wildtyp-Enzym die folgenden Varianten zur Vefügung: KTQ M747K, KTQ M747R, KTQ I614K, KTQ I614K+M747K (DM (KK)) und KTQ I614K+M747R (DM (KR)). Diese Varianten wurden biochemisch charakterisiert und zwei Varianten wurden in einer Kooperation mit dem Lehrstuhl für Biophysik und Strukturbiologie, Universität Konstanz durch M. Sc. Andreas Schnur im Rahmen seiner Dissertation kristallisiert. Die bisher unveröffentlichten Strukturen der KTQ M747K und KTQ DM (KK) im Komplex mit dem DNA-Substrat, zusammen mit dem Vergleich bereits bestehender Kristallstrukturen einer Y-Familie DNA-Polymerase (Dpo4) gaben neue Hinweise auf die Mechanismen, die das Überlesen von DNA-Schäden durch DNA-Polymerasen ermöglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass neben den bisher bekannten sterischen Besonderheiten der Y-Familie DNA-Polymerasen des Weiteren intensive elektrostatische Interaktionen mit dem DNA-Substrat von großer Bedeutung für das Überlesen von DNA Schäden sind.