Heterologous overexpression, purification and mass spectrometric analysis of the human tachykinin NK2 receptor and expression of the human dopamine D2 receptor

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2009
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Narasimhan, Vijay S.
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Heterologe Überexpression, Reinigung und massenspektrometrische Analyse des menschlichen Tachykinin NK2-Rezeptor und Expression des humanen Dopamin-D2-Rezeptor
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Dissertation
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Zusammenfassung

GPCRs bestehen aus einem großen Protein-Familie von Transmembran-Rezeptoren mit sieben Transmembran-Spanning-Domains aus diesem Sinne Moleküle außerhalb der Zelle und aktivieren Sie die Signalwege in der Zelle. Dies führt letztendlich zu zellulären Antwort. Tachykinin NK2 und D2L Dopamin-Rezeptoren gehören zur Klasse A des GPCRs. Die D2R ist ein wichtiger Dopamin-Rezeptoren im Gehirn und ist die wichtigste Ziel für die Parkinson-und Neuroleptika. Bis heute wurden nur zwei Strukturen von GPCRs veröffentlicht. NMR-und Röntgen-Kristallographie, erfordern relativ großen Mengen (Milligramm) des gereinigten Proteinen. Das Fehlen von Informationen über diese Proteine und die Wahrscheinlichkeit, dass sie sehr unterschiedlich in ihren individuellen Bedürfnissen hat keinen vernünftigen Ansatz für die heterologe Expression von GPCRs behindert. In meiner Untersuchung habe ich verschiedene Expressionssysteme für die Expression und Reinigung des menschlichen NK2 (hNK2) und D2L versucht (hD2L)-Rezeptoren für die weitere biophysikalische Studien. Meine ersten Versuche zum Ausdruck zu bringen GPCRs in E. coli und Drosophila Schneider 2-Zellen zeigten, dass beide Zell-Linien waren nicht in der Lage, diese Proteine zu äußern. Meine nächste Ansätze zur hNK2 und hD2L Rezeptoren in Sf9 Zellen exprimieren erfolgreich waren, aber nur mit geringen Erträgen. Die Verwendung von Zell-freie Meinungsäußerung Systeme GPCRs ausdrückte, war ebenfalls erfolgreich. Allerdings Aufstockung der GPCR Ausdruck Milligramm Mengen zu erhalten erwies sich als sehr teuer für den Ausdruck Systeme. Mein nächster Versuch war, die hD2L Rezeptor in methylotrophen Hefe Pichia pastoris zu äußern. In unserem Fall hD2L-Rezeptor wurde in P.pastoris ausgedrückt; und Reinigung wurde auf einem kleinen Maßstab erfolgreich. Allerdings waren die Erträge sehr gering, und die Zellen die Fähigkeit verloren, an das Protein bei der Lagerung zu produzieren. Die Verwendung von Fusionsproteinen zum Ausdruck zu bringen GPCRs zuvor berichtet wurde. Deshalb entschied ich mich an das Transmembran-Domäne der äußeren Membran Protein A beschäftigen (TM-OmpA) als Fusionspartner zu hNK2R in E.coli zum Ausdruck bringen. Ich entwarf ein Konstrukt Verschmelzung TM-OmpA und hNK2R Genen verbunden durch ein Enterokinase Spaltstelle zur Entfernung von TM-OmpA einmal das Protein als inclusion bodies gereinigt und zum Ausdruck kommt. Meine ersten Versuchen, das Fusionsprotein waren nicht erfolgreich. Ich spekuliert, dass das Problem auch an der Anwesenheit von seltenen Codons, die in hNK2R Gen, das in geringer Menge in E.coli Genom vorhanden sind, könnte. Der Austausch der seltenen Codons zu Ausdruck der TM-OmpA-hNK2R in Form von inclusion bodies in E.coli. Ich bemerkte, daß beide Partner die Fusion und den Austausch der seltenen Codon Schritte für den Ausdruck der hNK2R in E.coli notwendig waren. Nur SDS und LMPG konnten die inclusion bodies in angemessenem Umfang aufgelöst wird. Reinigung des Fusionsproteins mit einer Nickel-NTA Säule wurde nicht zufrieden stellend, da die meisten Proteine nicht binden an das Harz. Reinigung des LMPG aufgeschlossen Fusionsprotein und die Spaltung der Domains wurde nur in geringem Umfang erfolgreich. Deshalb entschied ich mich für einen anderen Ausdruck System GPCRs auszudrücken suchen.
Ich beschloss, die pMAL-c2 Vektor, der das Protein im Zytoplasma, statt sich auf, um die Membran wodurch die Ausbeute von exprimierten Proteins Ausdruck zu verwenden. Das Fusionsprotein wurde in hohen Mengen-und Expression wurde mittels Western Blot bestätigt. MBP-hNK2R wurde in Anwesenheit von 1% LDAO gereinigt mit Hilfe der Amylose-Harz und einem CM-Sepharose-Säule zu erhalten, ein reines MBP-hNK2R. Das gereinigte Fusionsprotein wurde mit Faktor Xa, die MBP-Domäne zu entfernen und die gereinigte gespalten. Die Ausbeute des gereinigten hNK2R wurde auf 0,3 mg / l E.coli Kultur bestimmt. Das gereinigte hNK2R wurde durch Western-Blot-und Masse-spektroskopische Analyse bestätigt. Erste Analyse der sekundären Struktur, die mit hNK2R Circulardichroismus zeigte, dass das Protein in erster Linie war α-Helix. Abschließend haben wir erfolgreich ein Verfahren entwickelt, für die Überexpression des menschlichen Tachykinin NK2-Rezeptor und entwickelt ein Protokoll für die effiziente Reinigung. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht über die Expression und Reinigung des hNK2R mit E.coli. Das E.coli-basierte Ausdruck der hNK2R sollte es uns ermöglichen, eine Strategie für die Rückfaltung NK2R, die dann Auflösen des funktionell aktiven Rezeptor, der die strukturellen, biochemischen erforderlich ist, erleichtern würde zu entwickeln, und biophysikalische Charakterisierung der hNK2R.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

GPCRs comprise a large protein family of transmembrane receptors composed of seven transmembrane spanning domains that sense molecules outside the cell and activate the signal transduction pathways inside the cell. This ultimately leads to cellular response. Tachykinin NK2 and Dopamine D2L receptors belong to the Class A of the GPCRs. The D2R is a major dopamine receptor in the brain and is the prime target for antiparkinsonian and antipsychotic drugs. Till date, only two structures of GPCRs have been published. NMR and X-ray crystallography, require relatively large amounts (milligrams) of purified proteins. The lack of information on these proteins and the probability that they are very diverse in their individual needs has hindered any rational approach to heterologous expression of GPCRs. In my study, I have tried various expression systems for the expression and purification of the human NK2 (hNK2) and D2L (hD2L) receptors for further biophysical studies. My initial trials to express GPCRs in E.coli and Drosophila Schneider 2 cells showed that both cell lines were not able to express these proteins. My next approaches to express the hNK2 and hD2L receptors in Sf9 cells were successful but only with low yields. The use of cell-free expression systems to express GPCRs was also successful. However, scaling up the GPCR expression to obtain milligram quantities turned out to be very expensive for both the expression systems. My next attempt was to express the hD2L receptor in methylotrophic yeast Pichia pastoris. In our case hD2L receptor was expressed in P.pastoris; and purification was successful on a small scale. However, the yields were very low and the cells lost the ability to produce the protein upon storage. The use of fusion proteins to express GPCRs has been reported previously. Therefore, I decided to employ the transmembrane domain of outer membrane protein A (TM-OmpA) as a fusion partner to express hNK2R in E.coli. I designed a construct fusing TM-OmpA and hNK2R genes connected through an enterokinase cleavage site for removal of TM-OmpA once the protein is expressed as inclusion bodies and purified. My initial attempts to express the fusion protein were not successful. I speculated that the problem could be due to presence of rare codons present in hNK2R gene that are present in low abundance in E.coli genome. The exchanges of the rare codons lead to expression of the TM-OmpA-hNK2R in the form of inclusion bodies in E.coli. I observed that both, the fusion partner and exchange of the rare codon steps were necessary for the expression of the hNK2R in E.coli. Only SDS and LMPG were able to solubilise the inclusion bodies to a reasonable extent. Purification of the fusion protein using a Nickel NTA column was not satisfactory as most of the protein did not bind to the resin. Purification of the LMPG solubilised fusion protein and cleavage of the domains was successful only in small scale. Therefore, I decided to search for another expression system to express GPCRs.
I decided to use the pMAL-c2 vector, which expresses the protein in cytoplasm instead of targeting it to the membrane thereby increasing the yield of expressed protein. The fusion protein was expressed in high quantities and expression was confirmed by western blotting. MBP-hNK2R was purified in the presence of 1% LDAO using the amylose resin and a CM-Sepharose column to obtain a pure MBP-hNK2R. The purified fusion protein was cleaved with Factor Xa to remove the MBP domain and purified. The yield of the purified hNK2R was determined to 0.3 mg/L of E.coli culture. The purified hNK2R was confirmed by western blot and mass spectroscopic analysis. Initial secondary structure analysis of the hNK2R using circular dichroism showed that the protein was predominantly α-helical. In conclusion, we have successfully developed a procedure for overexpression of the human tachykinin NK2 receptor and designed a protocol for its efficient purification. To our knowledge, this is the first report on expression and purification of the hNK2R using E.coli. This E.coli-based expression of the hNK2R should enable us to develop a refolding strategy for the NK2R, which would then facilitate reconstitution of the functionally active receptor, which is required for the structural, biochemical, and biophysical characterization of the hNK2R.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, Tachykinin NK2 receptor, Heterologous overexpression, human dopamine D2 receptor
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690NARASIMHAN, Vijay S., 2009. Heterologous overexpression, purification and mass spectrometric analysis of the human tachykinin NK2 receptor and expression of the human dopamine D2 receptor [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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December 14, 2009
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