Heterologous overexpression, purification and mass spectrometric analysis of the human tachykinin NK2 receptor and expression of the human dopamine D2 receptor

Abstract

GPCRs bestehen aus einem großen Protein-Familie von Transmembran-Rezeptoren mit sieben Transmembran-Spanning-Domains aus diesem Sinne Moleküle außerhalb der Zelle und aktivieren Sie die Signalwege in der Zelle. Dies führt letztendlich zu zellulären Antwort. Tachykinin NK2 und D2L Dopamin-Rezeptoren gehören zur Klasse A des GPCRs. Die D2R ist ein wichtiger Dopamin-Rezeptoren im Gehirn und ist die wichtigste Ziel für die Parkinson-und Neuroleptika. Bis heute wurden nur zwei Strukturen von GPCRs veröffentlicht. NMR-und Röntgen-Kristallographie, erfordern relativ großen Mengen (Milligramm) des gereinigten Proteinen. Das Fehlen von Informationen über diese Proteine und die Wahrscheinlichkeit, dass sie sehr unterschiedlich in ihren individuellen Bedürfnissen hat keinen vernünftigen Ansatz für die heterologe Expression von GPCRs behindert. In meiner Untersuchung habe ich verschiedene Expressionssysteme für die Expression und Reinigung des menschlichen NK2 (hNK2) und D2L versucht (hD2L)-Rezeptoren für die weitere biophysikalische Studien. Meine ersten Versuche zum Ausdruck zu bringen GPCRs in E. coli und Drosophila Schneider 2-Zellen zeigten, dass beide Zell-Linien waren nicht in der Lage, diese Proteine zu äußern. Meine nächste Ansätze zur hNK2 und hD2L Rezeptoren in Sf9 Zellen exprimieren erfolgreich waren, aber nur mit geringen Erträgen. Die Verwendung von Zell-freie Meinungsäußerung Systeme GPCRs ausdrückte, war ebenfalls erfolgreich. Allerdings Aufstockung der GPCR Ausdruck Milligramm Mengen zu erhalten erwies sich als sehr teuer für den Ausdruck Systeme. Mein nächster Versuch war, die hD2L Rezeptor in methylotrophen Hefe Pichia pastoris zu äußern. In unserem Fall hD2L-Rezeptor wurde in P.pastoris ausgedrückt; und Reinigung wurde auf einem kleinen Maßstab erfolgreich. Allerdings waren die Erträge sehr gering, und die Zellen die Fähigkeit verloren, an das Protein bei der Lagerung zu produzieren. Die Verwendung von Fusionsproteinen zum Ausdruck zu bringen GPCRs zuvor berichtet wurde. Deshalb entschied ich mich an das Transmembran-Domäne der äußeren Membran Protein A beschäftigen (TM-OmpA) als Fusionspartner zu hNK2R in E.coli zum Ausdruck bringen. Ich entwarf ein Konstrukt Verschmelzung TM-OmpA und hNK2R Genen verbunden durch ein Enterokinase Spaltstelle zur Entfernung von TM-OmpA einmal das Protein als inclusion bodies gereinigt und zum Ausdruck kommt. Meine ersten Versuchen, das Fusionsprotein waren nicht erfolgreich. Ich spekuliert, dass das Problem auch an der Anwesenheit von seltenen Codons, die in hNK2R Gen, das in geringer Menge in E.coli Genom vorhanden sind, könnte. Der Austausch der seltenen Codons zu Ausdruck der TM-OmpA-hNK2R in Form von inclusion bodies in E.coli. Ich bemerkte, daß beide Partner die Fusion und den Austausch der seltenen Codon Schritte für den Ausdruck der hNK2R in E.coli notwendig waren. Nur SDS und LMPG konnten die inclusion bodies in angemessenem Umfang aufgelöst wird. Reinigung des Fusionsproteins mit einer Nickel-NTA Säule wurde nicht zufrieden stellend, da die meisten Proteine nicht binden an das Harz. Reinigung des LMPG aufgeschlossen Fusionsprotein und die Spaltung der Domains wurde nur in geringem Umfang erfolgreich. Deshalb entschied ich mich für einen anderen Ausdruck System GPCRs auszudrücken suchen.Ich beschloss, die pMAL-c2 Vektor, der das Protein im Zytoplasma, statt sich auf, um die Membran wodurch die Ausbeute von exprimierten Proteins Ausdruck zu verwenden. Das Fusionsprotein wurde in hohen Mengen-und Expression wurde mittels Western Blot bestätigt. MBP-hNK2R wurde in Anwesenheit von 1% LDAO gereinigt mit Hilfe der Amylose-Harz und einem CM-Sepharose-Säule zu erhalten, ein reines MBP-hNK2R. Das gereinigte Fusionsprotein wurde mit Faktor Xa, die MBP-Domäne zu entfernen und die gereinigte gespalten. Die Ausbeute des gereinigten hNK2R wurde auf 0,3 mg / l E.coli Kultur bestimmt. Das gereinigte hNK2R wurde durch Western-Blot-und Masse-spektroskopische Analyse bestätigt. Erste Analyse der sekundären Struktur, die mit hNK2R Circulardichroismus zeigte, dass das Protein in erster Linie war α-Helix. Abschließend haben wir erfolgreich ein Verfahren entwickelt, für die Überexpression des menschlichen Tachykinin NK2-Rezeptor und entwickelt ein Protokoll für die effiziente Reinigung. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht über die Expression und Reinigung des hNK2R mit E.coli. Das E.coli-basierte Ausdruck der hNK2R sollte es uns ermöglichen, eine Strategie für die Rückfaltung NK2R, die dann Auflösen des funktionell aktiven Rezeptor, der die strukturellen, biochemischen erforderlich ist, erleichtern würde zu entwickeln, und biophysikalische Charakterisierung der hNK2R.