Etablierung einer 3D-Darmgewebekultur zur in-vitro-Untersuchung der Resorption potentieller Wirkstoffe auf Basis einer natürlichen Kollagenmatrix

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2009
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Pusch, Jacqueline
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Establishment of a 3D intestinal tissue culture for the prediction of the absorption behaviour of new drug candidates based on a natural collagen scaffold in vitro
Forschungsvorhaben
Organisationseinheiten
Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
Published
Erschienen in
Zusammenfassung

The dissertation describes the development of a three-dimensional intestinal tissue culture which reflects the physiological barrier by the simulation of the micro environment of the small intestine in vitro. Therefore an enhanced transfer of the experimental data from absorption studies in vitro to the human organism in vivo was expected.
The development of the intestinal tissue model was geared to the conventional oversimplified two-dimensional Caco-2 assay. This model is used at present for the classification of substances regarding its permeability at the intestinal barrier. For the assembling of the 2D-model the seeding of the cell line Caco-2 on a porous synthetic membrane and their static cultivation takes place over a cultivation period of 21 days.
For the improvement of the artificial 2D assay, physiological parameters were integrated gradually, to establish a new 3D intestinal tissue model.
At first the exchange of the synthetic membrane against an acellularised collagen scaffold from porcine jejunal segments took place.
This scaffold represents the natural micro environment for intestinal epithelial cells in vitro. Exclusively the remaining villus structure of the natural scaffold sustained the barrier function of the reseeded cells during permeation studies by the use of viscous or particular substances. However no improvement of the system could be obtained concerning the cell morphology under static culture conditions. Only the development of a 2-chamber-bioreactor system led to an improvement. This system realise the dynamic cultivation of the epithelial cells and the simultaneous implementation of directional permeation studies. The mechanical stimulation of the cells, based on the media perfusion, the improved nutrient supply and the removal of toxic metabolite was analysed to be the crucial factor for the change of the cell morphology.
Moreover the co-cultivation of epithelium cells with primary micro vascular endothelial cells represents the complete gut-blood-barrier and therefore the simulation of the mass transport across the intestinal lumen into the systemic circulation in vitro.
Due to the immunohistological characterization (anti-Villin) of the Caco-2 cells and the analysis of efflux protein activity (P-Glycoprotein), a significant reduction of the cultivation period, from 21-to 14-day-cultivation, could be realised. Directional absorption studies were successfully accomplished by the use of the efflux substrate Rhodamine 123. The analysis of low permeable substances (Fluoresceine and Desmopressin) resulted in a higher permeability for the dynamic 3D tissue model compared to the conventional 2D assay. This increased paracellular permeability of the cells within the enhanced 3D model rather equates to the physiological barrier function of the enterocytes in vivo.
Based on their carcinogenic and colorectal origin, the Caco-2 cells in general are not the optimal cells to represent the intestinal barrier in vitro. Therefore an otimized isolation and cultivation technique of primary intestinal epithelial cells from neonatal piglets was established. Due to the development of a cell culture medium as well as the modification of published isolation protocols the cultivation of the primary jejunal epithelial cells was possible over a cultivation period of 5 days within the enhanced 3D model. A cell population of enterocytes and goblet cells could be proven by immonohistological staining methods. Based on the high prismatic cell growth and the mucous layer theses cells reflect the physiological barrier of the small intestine more realistically.
Altogether the 3D tissue model could represent a new tool for the prediction of the intestinal permeation of new drug candidates in future. The experimental data obtained within this model showed a more physiological cell growth as well as a better in-vivo-in-vitro-correlation for low permeable substances. For the investigation, whether this model can be standardized for the screening of substances, further experimental data is necessary.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine dreidimensionale Darmgewebekultur etabliert welche die physiologische Barrierefunktion des Dünndarmepithels sowie die Mikroumgebung des Darmes in vitro simuliert und somit eine verbesserte Übertragbarkeit der Versuchsergebnisse auf den Menschen gewährleisten soll. Gleichzeitig stand ein einfacher und standardisierbarer Aufbau des Systems für eine zukünftige Nutzung für Mehrfachtestungen im Vordergrund.
Die Entwicklung des organoiden Darmgewebemodells orientierte sich dabei an dem etablierten zweidimensionalen Caco-2 Insertmodell. Dieses Modell wird zurzeit zur Klassifizierung von Substanzen hinsichtlich ihrer Permeabilität an der intestinalen Barriere eingesetzt. Für den Aufbau des 2D-Modells erfolgt die Aussaat der Zelllinie Caco-2 auf eine poröse Kunststoffmembran und deren statische Kultivierung über einen Zeitraum von 21 Tagen.
Als Weiterentwicklung des Modells wurden in dieser Arbeit die artifiziellen Kulturbedingungen des 2D-Modells zum Aufbau eines funktionellen 3D-Testsystems durch die Integration physiologischer Parameter schrittweise an die Umgebungsbedingungen des nativen Dünndarms angepasst. Zunächst erfolgte der Austausch der Kunststoffmembran gegen eine azellularisierte Kollagenmatrix aus Jejunumsegmenten.
Diese stellte die natürliche Mikroumgebung für die Epithelzellen dar. Die vorgegebene Zottenstruktur wies zusätzlich eine protektive Wirkung der rebesiedelten Zellen gegenüber viskösen und partikulären Substanzen während der Durchführung von Transportversuchen auf. Somit konnte die Barrierefunktion über die gesamte Versuchszeit aufrechterhalten werden. Es ließ sich jedoch unter statischer Kultivierung keine Optimierung des Systems hinsichtlich der Zellmorphologie nachweisen.
Erst die Entwicklung eines 2-Kammer-Bioreaktorsystems, der eine dynamische Kultivierung der Epithelzellen bei zeitgleicher Durchführung gerichteter Transportstudien realisieren sollte, führte zu einer Verbesserung. Bei der Auswertung der Experimente konnte der, über die Perfusion, in das System integrierte mechanische Stimulus als ausschlaggebender Parameter zur Veränderung der Zellmorphologie detektiert werden. Aufgrund der Dynamik, der verbesserten Nährstoffzufuhr und des Abtransports toxischer Metabolite erzielte die Reaktorkultivierung ein, für Enterozyten charakteristisches, hochprismatisches Wachstum der Caco-2 Zellen.
Die Co-Kultivierung von Epithelzellen mit primären mikrovaskulären Endothelzellen, ermöglichte darüber hinaus die Repräsentation der vollständigen Darm-Blut-Schranke und damit die Simulation des Stofftransports aus dem Darmlumen in den Körperkreislauf. Über eine immuhistologische Charakterisierung (Villin) der Caco-2 Zellen, sowie über die Untersuchung der Transporteraktivität (P-Glycoprotein) konnte dabei eine Reduktion der, bis zur Durchführbarkeit von Transportversuchen, notwendigen Kultivierungszeit von 21 Tage auf 14 Tage nachgewiesen werden. Innerhalb des 3D- Modells ließen sich gerichtete Transportstudien auf Basis des Effluxsubstrats Rhodamine 123 erfolgreich durchführen. Des Weiteren ergab der Vergleich des Transportes von Fluorescein und Desmopressin, als niederpermeable Substanzen, eine höhere Durchlässigkeit für das dynamische 3D- Modell als für das 2D- Modell. Diese erhöhte parazelluläre Permeabilität der Caco-2 Zellen entspricht eher der Barriereeigenschaft des Dünndarmepithels in vivo als die, für das 2D- Modell, gemessenen Werte. Da jedoch generell die Verwendung der Caco-2 Zelllinie aufgrund ihres kanzerogenen und kolorektalen Ursprungs infrage zu stellen ist, war alternativ die Isolation und Kultur von primären Dünndarmepithelzellen aufzubauen.
Die Etablierung eines neuen Zellkulturmediums sowie die Modifizierung bisher veröffentlichter Isolationsprotokolle ermöglichte dabei erstmals eine 5-tägige Kultivierung primärer porciner Epithelzellen innerhalb des 3D- Modells. Es konnte eine Zellpopulation aus Enterozyten und Becherzellen des Dünndarms nachgewiesen werden, die anhand des einschichtigen, hochprismatischen Wachstums der Epithelzellen in Verbindung mit der Mucusschicht die Physiologie und Morphologie des Dünndarms realistisch widerspiegelte.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte damit sowohl ein dreidimensionales Darmtestsystem auf Basis einer natürlichen Kollagenmatrix als auch ein Bioreaktorsystem für dessen dynamische Kultivierung entwickelt werden. Im Vergleich zum standardisierten, zweidimensionalen Caco-2 Modell ließ sich damit zum einen ein charakteristischeres Zellwachstum erzielen sowie in einigen der durchgeführten Transportversuchen eine verbesserte In-vitro-In-vivo-Korrelation der Daten.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
P-Glycoprotein, Tissue engineering, Caco-2, scaffold
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690PUSCH, Jacqueline, 2009. Etablierung einer 3D-Darmgewebekultur zur in-vitro-Untersuchung der Resorption potentieller Wirkstoffe auf Basis einer natürlichen Kollagenmatrix [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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September 21, 2009
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