Schnelle Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie in lebenden Zellen : Untersuchung von Proteininteraktionen, Proteinmodifikationen und Proteinaktivität

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Einsatz der FLIM-FRET-Mikroskopie zur Untersuchung vielfältiger dynamischer Proteinaktivität in lebenden Zellen. FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) bezeichnet die räumliche Messung von Fluoreszenzlebenszeiten im bildgebenden Verfahren und ermöglicht die direkte und robuste Detektion des Förster Resonanz Energietransfers (FRET). Unter FRET versteht man die strahlungslose Energieübertragung zwischen zwei benachbarten Fluorophoren in einem Abstandsbereich von wenigen Nanometern. Im weitesten Sinne dient die Beobachtung von FRET zur Untersuchung von Phänomenen, die auf der Änderung von räumlicher Nähe beruhen. Das Prinzip basiert darauf, Moleküle oder Molekülbestandteile mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren. Nähern sich die Fluorophore beispielsweise durch Interaktion der beiden Moleküle auf wenige Nanometer an, so kann dies durch eine Änderung der Fluoreszenzlebenszeit infolge von FRET detektiert werden.Im Rahmen dieser Arbeit wurde die FLIM-FRET-Mikroskopie angewandt, um Proteinwechselwirkungen, Proteinmodifikationen und Proteinaktivität zu visualisieren. Um dynamische Prozesse in lebenden Zellen räumlich und zeitlich aufzulösen, wurde zunächst ein optisches Experiment aufgebaut, mit dem sehr schnelle FLIM-Messungen mit Aufnahmezeiten von wenigen Sekunden erzielt werden können. Beim zugrunde liegenden Weitfeld-Mikroskop erfolgt die Messung der Fluoreszenzlebenszeit in der Frequenzdomäne unter Verwendung einer modulierten Bildverstärker-Kamera, mit der das zeitlich-aufgelöste Fluoreszenzsignal in allen Pixeln parallel detektiert werden kann. Nach der Etablierung und Charakterisierung des neu aufgebauten Experiments erfolgte die Anwendung in Kooperationen mit den Arbeitsgruppen Hauck, Wittmann, May und Marx (Universität Konstanz).Proteinwechselwirkungen spielen eine entscheidene Rolle bei der Informationsweitergabe in zellulären Signalkaskaden. Die Lebendzell-Mikroskopie konnte einen Beitrag dazu leisten, die Signalkaskade des phagozytischen Immunrezeptors CEACAM3 zu beleuchten. Die direkte Interaktion des CEACAM3-Rezeptors mit seinen Effektorproteinen sollte durch FRET nachgewiesen werden. Konkret sollte untersucht werden, wie die Rekrutierung unterschiedlicher CEACAM3-Interaktionspartner an eine einzige Bindestelle räumlich und zeitlich koordiniert wird. Eine sequentiell-hierarchisch Abfolge von Interaktionen konnte dabei nicht nachgewiesen werden. Stattdessen wurde bei allen untersuchten Interaktionspartnern eine unmittelbare Bindung an den aktivierten Rezeptor nach Kontakt mit pathogenen Bakterien festgestellt. Mithilfe der FRET-Mikroskopie konnte zum ersten Mal die Interaktion des CEACAM3-Rezeptors mit der Tec Kinase im Kontext intakter Zellen gezeigt werden.Im Rahmen der Untersuchung zellulärer Signalwege entstand die Idee, die FLIMFRET- Mikroskopie zur Untersuchung posttranslationaler Proteinmodifikationen einzusetzen. Unter dem Begriff versteht man die Enzym-katalysierte kovalente Verknüpfung von chemischen Gruppen an Aminosäurereste. Posttranslationale Modifikationen spielen eine fundamentale Rolle bei der Regulierung von Proteinaktivität, -lokalisation und Protein-Protein-Interaktion. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein neuartiger Ansatz verfolgt, mit dem posttranslationale Modifikationen protein-spezifisch in lebenden Zellen visualisiert werden können. Dabei wird das untersuchte Protein mit dem enhanced green fluorescent protein (EGFP) als FRET-Donor fusioniert; zusätzlich wird die Modifikation mit einem FRET-Akzeptor markiert. Der Fluorophor an der Proteinmodifikation kann unter Verwendung unnatürlicher Vorläufermoleküle eingeführt werden. Diese können entweder bereits mit einem Fluoreszenzfarbstoff modifiziert sein oder eine chemische Reportergruppe tragen, die durch eine bioorthogonale Reaktion mit einem Farbstoff markiert werden können. Auf diese Weise kann durch die Messung der Fluoreszenzlebenszeit des FRET-Donors der Modifizierungsstatus des untersuchten Proteins detektiert werden. So gelang es durch die Verwendung chemisch-modifzierter Zucker zum ersten Mal, die Glykosylierung spezifischer intrazellulärer Proteine in lebenden Zellen zu visualisieren. In ähnlicher Weise wurden Nukleotid-Analoga dazu eingesetzt, die Modifikation spezifischer Proteine durch Poly(ADP-Ribos)ylierung infolge von DNA-Schäden räumlich aufzulösen.Eine der wichtigsten Aufgaben von Proteinen ist die enzymatische Katalyse von biochemischen Reaktionen. ATP spielt dabei eine entscheidene Rolle als Energielieferant. Die enzymatische Aktivität von Proteinen kann durch den Einsatz fluorogener ATP-Sonden beobachtet werden, deren Spaltung durch Auslesen intramolekularen FRETs detektiert werden kann. Unter Verwendung der Elektroporation gelang es zum ersten Mal, zweifach-modifizierte ATP-Analoga in intakte Zellen einzubringen und deren Spaltung innerhalb der zellulären Umgebung durch FRET-Mikroskopie zu beobachten. Die schnelle Weitfeld-FLIM-Mikroskopie ist darüber hinaus hervorragend dazu geeignet, die Spaltung der ATP-Analoga in lebenden Zellen in Echtzeit zu verfolgen.