Characterization of peptidoglycan-recovering enzymes of Clostridium acetobutylicum

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Zusammenfassung

The cell wall is the essential exoskeleton of most bacteria that maintains cell shape and protects the cell against osmotic lysis. The major component of the bacterial cell wall is the peptidoglycan, a heteropolymer consisting of glycan strands cross-linked by short peptides. Despite its rigidity, the peptidoglycan is a highly dynamic structure, which is continuously undergoing turnover and remodeling during cell growth and division. In Gram-negative bacteria like Escherichia coli, peptidoglycan fragments released during this turnover process are reutilized (recycled) efficiently. However, it is still unknown whether recycling also proceeds in Gram-positive bacteria. Recently, a pathway for the recovery of peptidoglycan fragments, which involves the sequential processing of N-acetylglucosamine-N-acetylmuramic acid-peptides (muropeptides) by the secreted enzymes N-acetylglucosaminidase (NagZBs) and N-acetylmuramic acid-L-alanine amidase (AmiEBs), has been proposed for the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Orthologs of muropeptide recycling enzymes of B. subtilis are also present in Clostridium acetobutylicum, an anerobic Gram-positive solvent producer that is closely related to Bacillus. We recognized that orthologs of NagZ (CA_C0182) and AmiE (CA_C0181) of C. acetobutylicum are apparently not secreted as in B. subtilis, indicating that catabolism of muropeptides may proceed different.

This thesis presented here investigates the peptidoglycan recycling pathway of C. acetobutylicum and focuses on two enzymes showing a novel specificity for the amino sugars of the bacterial peptidoglycan, N-acetylglucosamine (GlcNAc) and N-acetylmuramic acid (MurNAc). We identified a kinase of C. acetobutylicum, named MurK (formerly CA_C0183), which is encoded by a gene that is clustered with putative recycling genes. MurK catalyzes the phosphorylation of both GlcNAc and MurNAc at the 6-position, yielding GlcNAc-6-phosphate and MurNAc-6-phosphate, respectively. The biochemical characterization of MurK revealed a 1.5-fold higher catalytic activity for GlcNAc than for MurNAc. Applying phosphorylation assays using radioactive ATP indicated that structurally related cell wall sugars, i.e., epimers (N-acetylgalactosamine and N-acetylmannosamine), non-N-acetylated derivatives (glucosamine and muramic acid) and an anhydro form of MurNAc (1,6-anhydroMurNAc) are no substrates for this enzyme. MurK displays no amino acid sequence similarity with the amino sugar kinases AnmK and NagK of E. coli but with human GlcNAc kinase. We showed that MurK kinase can be used for a sensitive detection of the cell wall sugars at amounts as low as 5 fmol. Within the same gene cluster downstream of murK on the genome of C. acetobutylicum, we identified a second encoded enzyme, a novel acetyltransferase, named GlmA (formerly CA_C0184). It catalyzes the formation of GlcNAc by the transfer of an acetyl group from acetyl coenzyme A to glucosamine (GlcN) and terminal nonreducing GlcN residues, respectively. We determined a 3- to 4-fold higher catalytic efficiency of GlmA for linear di- and trisaccharides composed of β-1,4-glycosidically linked GlcN residues, compared to GlcN. However, the lactic acid derivative of GlcN, muramic acid, did not serve as an acetyl acceptor of GlmA. Acetylation assays with muropeptides derived from peptidoglycan of B. subtilis revealed that non-N-acetylated GlcN residues had to be N-acetylated by GlmA prior to the release of terminal GlcNAc by the N-acetylglucosaminidase NagZBs, whereas peptidoglycan of E. coli lacking these N-deacetylated modifications could not be acetylated by GlmA.

In conclusion, the results presented in this thesis indicate that MurK, the GlcNAc/MurNAc kinase, and GlmA, the glucosamine/glucosaminide N-acetyltransferase, both are involved in a putative recycling pathway in C. acetobutylicum, which proceeds distinct to the known pathways of B. subtilis and E. coli. Our model of the C. acetobutylicum peptidoglycan recycling proposes that de-N-acetylated muropeptides liberated during cell wall turnover are transported into the cell by the putative ABC transporter AppABCDF. In the cytoplasm, recovery of GlcN residues requires N-acetylation at the nonreducing end by GlmA. The generated terminal GlcNAc can then be released from muropeptides by NagZ and MurNAc from the peptide moiety by AmiE. Both amino sugars can now be used for phosphorylation by the MurK kinase, yielding GlcNAc- and MurNac-6-phosphate, respectively. Further processing involves the conversion of MurNAc-6-phosphate to GlcNAc-6-phosphate by the MurQ etherase, which enters, after deacetylation, either glycolysis or the peptidoglycan biosynthesis pathway.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Die Zellwand ist ein essentielles Exoskelett nahezu aller Bakterien, das die Zellform aufrecht erhält und die Zelle gegen osmotische Lyse schützt. Hauptbestandteil der bakteriellen Zellwand ist Peptidoglykan, ein Heteropolymer bestehend aus Glykansträngen, die über kurze Peptidketten quervernetzt sind. Trotz seiner Starrheit ist Peptidoglykan eine hochdynamische Struktur, die im Laufe des Zellwachstums und der Zellteilung kontinuierlich dem Turnover und der Remodellierung unterliegt. Während des Turnoverprozesses freigesetzte Peptidoglykanfragmente werden von Gram-negativen Bakterien wie Escherichia coli effizient wiederverwertet (recycelt). Ob auch in Gram-positiven Bakterien Recycling stattfindet, ist allerding noch unbekannt. Für das Gram-positive Bakterium Bacillus subtilis wurde kürzlich ein Abbauweg für die Wiedergewinnung von Peptidoglykanfragmenten entdeckt, der die aufeinanderfolgende Umsetzung von N-Acetylglukosamin-N-Acetylmuraminsäure-Peptiden (Muropeptide) durch die sekretierten Enzyme N-Acetylglukosaminidase (NagZBs) und N-Acetylmuraminsäure-L-Alanin Amidase (AmiEBs) beinhaltet. Auch in Clostridium acetobutylicum, einem anaeroben Gram-positiven Lösungsmittelproduzenten, der eng mit Bacillus verwandt ist, sind Orthologe von Muropeptid recycelnden Enzymen aus B. subtilis vorhanden. Wir haben erkannt, dass Orthologe von NagZ (CA_C0182) und AmiE (CA_C0181) aus C. acetobutylicum anscheinend nicht wie in B. subtilis sekretiert werden, weshalb der Abbau von Muropeptiden möglicherweise anders verläuft.

Die vorliegende Promotionsarbeit untersucht den Peptidoglykanrecyclingweg von C. acetobutylicum und fokussiert auf zwei Enzyme mit einer neuartigen Spezifität für die Aminozucker des bakteriellen Peptidoglykans, N-Acetylglukosamin (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc). Wir identifizierten eine Kinase von C. acetobutylicum, benannt MurK (früher CA_C0183), die durch ein Gen kodiert wird, welches mit anderen vermutlichen Recyclinggenen in einem Cluster organisiert ist. MurK katalysiert jeweils die Phosphorylierung von GlcNAc und MurNAc an Position 6 zu GlcNAc-6-Phosphat und MurNAc-6-Phosphat. Die biochemische Charakterisierung von MurK offenbarte eine 1,5-fach höhere katalytische Aktivität für GlcNAc im Vergleich zu MurNAc. Anhand von Phosphorylierungsuntersuchungen mit radioaktivem ATP wurde gezeigt, dass strukturell verwandte Zellwandzucker, d.h. Epimere (N-Acetylgalaktosamin und N-Acetylmannosamin), nicht-N-acetylierte Derivate (Glukosamin und Muraminsäure) und eine Anhydroform von MurNAc (1,6-anhydroMurNAc) keine Substrate für dieses Enzym sind. MurK weist keine Gemeinsamkeiten in der Aminosäuresequenz mit den Aminozuckerkinasen AnmK und NagK von E. coli auf, allerdings gibt es geringe Übereinstimmungen mit der menschlichen GlcNAc Kinase. Zudem wurde gezeigt, dass die MurK Kinase verwendet werden kann, um Zellwandzucker bis zu Mengen von 5 fmol nachzuweisen. Ein zweites kodiertes Enzym wurde innerhalb desselben Clusters stromabwärts von murK auf dem Genom von C. acetobutylicum als eine neuartige Acetyltransferase identifiziert und GlmA genannt (früher CA_C0184). Es katalysiert die Bildung von GlcNAc durch den Transfer einer Acetylgruppe von Acetyl-Coenzym A auf Glucosamin (GlcN) sowie endständige nichtreduzierte GlcN-Reste. Die katalytische Effizienz von GlmA für lineare Di- und Trisaccharide bestehend aus β-1,4-glykosidisch verknüpften GlcN-Resten ist im Vergleich zu GlcN um das Drei- bis Vierfache erhöht. Allerdings dient das Milchsäurederivat von Glukosamin, die Muraminsäure, nicht als Acetyl-Akzeptor von GlmA. Weitere Acetylierungsversuche mit Muropeptiden, freigesetzt aus dem Peptidoglykan von B. subtilis, zeigten, dass nicht-N-acetylierte GlcN-Reste erst acetyliert werden müssen, bevor die N-Acetylglucosaminidase NagZBs das endständige GlcNAc abspaltet. Peptidoglykan von E. coli hingegen, dem diese N-deacetylierten Modifizierungen fehlen, konnte nicht durch GlmA acetyliert werden.

Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass MurK, die GlcNAc/MurNAc Kinase, und GlmA, die Glukosamin/Glukosaminid N-Acetyltransferase, eine wesentliche Rolle in einem möglichen Recyclingweg spielen, der sich von den bekannten Abbauwegen aus B. subtilis und E. coli unterscheidet. Unser Modell für das Peptidoglykanrecycling in C. acetobutylicum beschreibt, dass die während des Zellwandturnovers freigesetzten de-N-acetylierten Muropeptide mit Hilfe des mutmaßlichen ABC Transporters AppABCDF in die Zelle aufgenommen werden. Die Wiedergewinnung von GlcN-Resten im Zytoplasma erfordert die N-Acetylierung am nichtreduzierten Ende. Das so entstandene endständige GlcNAc kann nun vom Muropeptid durch NagZ freigesetzt werden, während AmiE den Peptidanteil von MurNAc abspaltet. Beide Aminozucker können anschließend durch die MurK Kinase zu GlcNAc- und MurNAc-6-Phosphat phosphoryliert werden. Im weiteren Verlauf wird MurNAc-6-Phosphat durch die Etherase MurQ zu GlcNAc-6-Phosphat umgewandelt, welches nach erfolgter Deacetylierung entweder über die Glykolyse verstoffwechselt wird oder erneut für die Peptidoglykan-Biosynthese zur Verfügung steht.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Zellwand, Peptidoglykan, Clostridium acetobutylicum, Peptidoglycan turnover, Cell wall recycling, Muropeptide recovery, MurK, GlmA
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690REITH, Jan, 2012. Characterization of peptidoglycan-recovering enzymes of Clostridium acetobutylicum [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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May 7, 2012
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