Termite gut flagellates and their bacterial symbionts: Phylogenetic analysis and localization in situ

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Datum
2004
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Stingl, Ulrich
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Termitendarmflagellaten und ihre bakteriellen Symbionten: Lokalisierung und Identifizierung in situ
Forschungsvorhaben
Organisationseinheiten
Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
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Zusammenfassung

This thesis summarizes a series of studies concerning the tripartite symbioses of bacteria with protozoa in the gut of wood-feeding lower termites. These associations presumably play a key role for the digestion of lignocellulose and the function of the termite gut.
A prerequisite for the understanding of the specificity of these symbioses is the identification of the respective protozoan species. Whereas the parabasalid flagellates in Reticulitermes flavipes are well characterized and clearly defined, the case for the morphological variable oxymonad protists in this termite was controversially discussed in the literature. By using molecular tools, it was shown that the morphological variety of these flagellates in Reticulitermes flavipes also reflects a genetical variety, and is not due to different developmental stages of the same organism.
Protozoan cells represent the most important habitat for bacteria in the highly structured termite gut. By using T-RFLP analysis and a comparison of 16S rRNA gene libraries from different microniches within the gut of Reticulitermes santonensis, it was shown that the bacterial community associated with the flagellates differs considerably from those in the surrounding gut fluid or located at the gut wall. The most abundant sequences in the flagellate fraction stemmed from the so-called Termite group 1 bacteria (TG-1). These results demonstrate the presence of a specific microbiota colonizing the flagellates.
For the exact identification of the bacteria associated with specific flagellates, a technique for isolation of single protozoan species and the subsequent phylogenetic analysis of the bacterial DNA of these fractions was established and used for investigating the symbioses of the two largest flagellates in Reticulitermes santonensis (Trichonympha agilis, Hypermastigida; Pyrsonympha vertens, Oxymonadida) with endosymbiotic bacteria. These two flagellates, while being only distantly related, harbor numerous morphologically similar bacteria in the cytoplasm. It was shown that these endosymbionts are also phylogenetically closely related and represent two distinct groups of TG-1, thus corroborating the results obtained with flagellate suspensions. Now, for the first time, the exact location and the morphotype of the bacteria in this new bacterial phylum is clarified. By designing a specific PCR-assay for TG-1, the distribution of these bacteria in termite species from nearly all famillies and in the flagellates-harboring cockroach Cyptocercus punctulatus was determined. Interestingly, TG-1 were not present in the evolutionary higher termites, which also have lost their flagellates, but were present in all lower termites and the flagellates--harboring cockroach Cyptocercus punctulatus, indicating a co-evolution of symbiotic bacterium and protozoan host. Based on these results, the classification of the Termite Group 1 as new candidate phylum Endomicrobia containing two candidate species Candidatus Endomicrobium pyrsonymphae and Candidatus Endomicrobium trichonymphae was proposed.
Except for attached spirochetes on oxymonad protists, surface-associated bacteria are not reported for the flagellates in Reticulitermes spp. Therefore, the symbiosis of bacteria attached to the hypermastigid flagellate Staurojoenina sp. from the dry-wood termite Neotermes cubanus was investigated. Interestingly, the 16S rRNA gene sequence of this symbiont forms together with other termite-derived sequences a termite-specific cluster among the Bacteroidales, which is hypothesized to consist of sequences of epibiotic bacteria of other gut flagellates.
The results obtained in these studies together with a critical literature survey on the topic and the current standing are summarized in a review. The established methods were also used in other projects to investigate symbiotic bacteria and microbial activities in intestinal tracts of beetle larvae and isopods. The results of these studies can be found in the appendix of the thesis.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Die vorliegende Arbeit umfasst eine Reihe unterschiedlicher Studien über die Symbiose von Bakterien mit Protozoen im Darm niederer Termiten. Diese Symbiosen spielen vermutlich eine Schlüsselrole für den Verdau von Lignozellulose im Termitendarm.
Eine Vorraussetzung, um die Spezifität der einzelnen Symbiosen zu untersuchen, ist die eindeutige Identifikation der jeweiligen Protozoenarten. Während die Flagellatenarten der Klasse Parabasalia aus Reticulitermes flavipes gut charakterisiert und klar definiert sind, wurde die Anzahl der morphologisch sehr variablen Oxymonadenarten in dieser Termite in der Literatur bisher kontrovers diskutiert. Durch den Einsatz molekularbiologischer Methoden konnte gezeigt werden, dass die morphologische Vielfalt dieser Flagellaten in Reticulitermes flavipes auch einer genetischen Vielfalt entspricht. Damit konnte widerlegt werden, dass die verschiedenen Morphotypen verschiedenen Entwicklungsstadien desselben Organismus entsprechen.
Protozoen stellen das wichtigste Habitat für Bakterien im hoch strukturierten Termitendarm dar. Ein Vergleich der mikrobiellen Lebensgemeinschaften in verschiedenen Mikronischen innerhalb des Darmes von Reticulitermes santonensis mittels T-RFLP und einem Vergleich von 16S rDNA Klonbibliotheken, zeigte, dass sich die Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften welche mit den Flagellaten assoziiert ist, deutlich von denen in der Darmflüssigkeit und dem Biofilm an der Darmwand unterscheidet. Die Bakterien der Termite Group 1 (TG-1) konnten bei diesen Studien als zahlenmässig wichtigste Flagellaten-assoziierte Bakterien identifiziert werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine spezifische, Flagellaten-assozierte bakterielle Lebensgemeinschaft existiert.
Um die genaue Identifizierung der Bakterien, die mit bestimmten Flagellaten assoziiert sind, zu ermöglichen, wurde eine Methode zur Vereinzelung einzelner Protozoenarten und der darauffolgenden phylogenetischen Analyse der bakteriellen DNA etabliert. Diese Methode wurde eingesetzt, um die symbiontischen Bakterien der zwei größten Flagellatenarten in Reticulitermes santonensis (Trichonympha agilis, Hypermastigida; Pyrsonympha vertens, Oxymonadida) zu untersuchen. Obwohl diese zwei Flagellaten nur sehr entfernt miteinander verwandt sind, beherbergen sie zahllose morphologisch ähnliche Bakterien im Zytoplasma. Die phylogenetische Analyse dieser Bakterien ergab, dass sie sehr eng miteinander verwandt sind und zwei unterschiedliche Gruppen der TG-1 repräsentieren, womit die Ergebnisse der T-RFLP-Analysen der verschiedenen Mikronischen des Darmes bestätigt wurden. Damit konnten zum ersten Mal die genaue Lokalisierung und die Morphologie der TG-1 Bakterien geklärt werden. Die Verteilung der TG-1 Bakterien in verschiedenen Termitenarten fast aller Termitenfamilien und der Flagellaten-beherbergenden Schabe Cryptocercus punctulatus wurde mithilfe eines spezifische, neu-entwickelten PCR-basierten Ansatzes untersucht. Interessanterweise konnten TG-1 Bakterien in höheren Termiten, die auch keine symbiontischen Flagellaten besitzen, nicht nachgewiesen werden, während sie in allen niederen Termiten sowie in der untersuchten Schabe, vorhanden waren. Diese Ergebnisse deuten auf eine Ko-Evolution zwischen symbiontischem Bakterium und Protozoenwirt hin. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Klassifizierung der Termite Group 1 als neues candidate phylum mit dem Namen Endomicrobia vorgeschlagen. Dieses neue Phylum beinhaltet die zwei oben erwähnten Endosymbionten als candidate species , Candidatus Endomicrobium pyrsonymphae und Candidatus Endomicrobium trichonymphae .
Die Flagellaten aus Reticulitermes spp. besitzen, außer an Oxymonaden angeheftete Spirocheten, keine Ektosymbionten. Um trotzdem die Phylogenie Oberflächen-assoziierter Bakterien auf Termitendarmflagellaten untersuchen zu können, wurden die Ektosymbionten der hypermastigiden Flagellatenart Staurojoenina sp. aus der Trockenholz-Termite Neotermes cubanus als Modellobjekt gewählt. Diese 16S rRNA Gensequenzen dieser Symbionten bilden interessanterweise zusammen mit anderen Sequenzen aus verschiedenen Termiten einen Termiten-spezifischen Cluster innerhalb der Bacteroidales, der vermutlich nur aus Sequenzen ektosymbiontischer Bakterien verschiedener Flagellaten besteht.
Die Ergebnisse dieser Studien wurden zusammen mit einem kritischen Literaturüberblick über das Thema in einem Review-Artikel zusammengefasst. Die im Rahmen der Arbeit etablierten Methoden wurden auch in anderen Projekten angewendet. Die Ergebnisse dieser Arbeiten befinden sich im Anhang dieser Dissertation.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
T-RFLP, Termitendarm, Termite gut
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690STINGL, Ulrich, 2004. Termite gut flagellates and their bacterial symbionts: Phylogenetic analysis and localization in situ [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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December 10, 2004
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