Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen Membranen und Sucroseporin als Beispiel eines rekonstituierten Membranproteins

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Datum
2001
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Weiland, Ulrich Michael
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Scanning force microscopy investigations of native biological membranes and Sucrose Porin as an example of a reconstituted membrane protein
Forschungsvorhaben
Organisationseinheiten
Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
Published
Erschienen in
Zusammenfassung

In the first part of this thesis methods for the immobilisation of biological objects on sufficiently smooth and clean surfaces were investigated. Appropriate substrates for scanning force microscopy (SFM) investigations are poly(vinyl phenyl ketone), PVPK, and several variants of furan polymers (FP). These materials allow both a functionalisation as specific cell culture substrate (PVPK, FP) and the variation of surface properties for the immobilisation of diverse membrane and protein preparations (FP). Thus, e.g. laminin can be adsorbed directly with a slightly increased roughness. Cells attach to this substrate in a mechanically stable fashion and show normal growth behaviour. The suitability of PVPK was shown with primary cultures and several cultured cell lines. Furan polymer substrates proved to be particularly suitable for the immobilisation of membrane preparations out of an aqueous suspension. Additionally, it could be shown that macromolecules can be adsorbed on modifications of FP.
The reconstitution of Sucrose Porin with lipids and subsequent SFM-investigation represents the second part of this study. Both the surface exposed to the extracellular medium and the periplasmic surface of the protein could be imaged by SFM with submolecular resolution. The data was analysed using single particle averaging methods. Thus, it became possible to discriminate the electrolyte-exposed surfaces and to characterise domains of different flexibility. In the case of the periplasmic side, the more or less dominating influence of a flexible structure on the imaging process was observed. Depending on the applied force, however, the rigid periplasmic core of the beta-barrel trimer could be revealed as well. This is in good agreement with recent assumptions concerning the size and properties of an N-terminal coiled coil structure. On the extracellular surface, imaging was influenced by the force dependent contribution of loops exposed at the rim of the beta-barrel.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Gegenstand dieser Arbeit sind zum einen Methoden der Immobilisierung biologischer Objekte auf ausreichend glatten und sauberen Oberflächen. Als für rasterkraftmikroskopische Untersuchungen geeignete Substrate haben sich Polyvinylphenylketon (PVPK) und verschiedene Varianten von Furanpolymeren (FP) erwiesen. Diese ermöglichen sowohl eine Funktionalisierung als spezifisches Zellkultursubstrat (PVPK, FP) als auch die Variation von Oberflächeneigenschaften für die Immobilisierung verschiedener Membran- und Proteinpräparationen (FP). So kann z. B. Laminin direkt mit geringfügig erhöhter Rauhigkeit adsorbiert werden. Zellen haften hierauf stabil und zeigen normales Wachstumsverhalten. Die Eignung von PVPK wurde an Primärkulturen sowie verschiedenen Zell-Linien gezeigt. Substrate aus verschiedenen FP erwiesen sich als besonders günstig für die Immobilisierung von Membranpräparationen aus wässriger Suspension. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass auf Modifikationen von FP auch Makromoleküle adsorbiert werden können.
In einem zweiten Teilprojekt wurde mit Lipiden rekonstituiertes Sucroseporin untersucht. Sowohl die zum extrazellulären Medium als auch die zum Periplasma exponierten Oberflächen konnten mit submolekularer Auflösung abgebildet werden. Die Messdaten wurden mit Hilfe von Verfahren der Einzelpartikelmittelung analysiert. So war es möglich, die Topographie der elektrolytexponierten Oberflächen zu unterscheiden und jeweils Domänen unterschiedlicher Flexibilität zu charakterisieren. Im Fall der periplasmatischen Seite kam es, je nach Auflagekraft, zu einem mehr oder weniger dominierenden Einfluss einer flexiblen Teilstruktur auf die Abbildung, das starre beta-Barrel-Trimer konnte aber ebenfalls dargestellt werden. Dieser Befund steht in Einklang mit bisherigen Annahmen zu den Abmessungen und Eigenschaften eines N-terminalen Coiled-Coil. Bei der extrazellulären Seite konnte der kraftabhängige Beitrag exponierter Loops am beta-Barrel zur Abbildung gezeigt werden.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Polymere, Oligodendrozyt, Fibroblast, CAR-Zelle, EPC-Zelle, 3T3-Zelle, Purpurmembran, Na,K-ATPase, IgM, Collagen, Laminin, 2D-Kristalle, scanning force microscopy, immobilization, sucrose porin, reconstitution, image processing, cell culture, proteins, membrane preparations
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690WEILAND, Ulrich Michael, 2001. Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen Membranen und Sucroseporin als Beispiel eines rekonstituierten Membranproteins [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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July 2, 2001
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