Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli

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Datum
2005
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Seitz, Sabine
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Analysis of the transport mediated gene regulation in the Mlc-PtsG-system of Escherichia coli
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Zeitschriftenheft
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Dissertation
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Zusammenfassung

Mlc from Escherichia coli is a global transcriptional regulator that represses the expression of different systems which are needed for transport and utilization of carbohydrates. On the other hand, the Mlc regulated genes are activated by the cAMP/CAP complex. Among the genes regulated by Mlc are whose products are part of PEP dependent phosphotransferase systems (PTS). In addition these PTS-components have regulatory function for themselves. Thus, EIIAGlc influences the enzyme adenylyl cyclase which makes cAMP from ATP. Mlc itself is inactivated by binding to PtsG, the glucose-specific EIICB. Mlc is bound to dephosphorylated PtsG which is found during active transport of glucose. Thus, in the Mlc-PtsG-system the formation of the activator cAMP/CAP and the activity of the repressor Mlc are regulated in dependence of the active transport of glucose via PtsG.

In this paper it was shown that the soluble, cytoplasmic B-domain is sufficient for the binding of Mlc to PtsG, also if this domain is expressed as a single peptide independent of the rest of the protein. Derepression of the Mlc-regulated genes is only achieved when the B-domain is fixed to the membrane with a membrane anchor and therefore the repressor Mlc is titrated to the membrane. In this case it is possible to fuse IIBGlc to a membrane protein which has no similarity to the C-domain of PtsG. Besides, it could be shown that Mlc binds to a region of the B-domain that overlaps with the binding side of EIIAGlc and that is in direct proximity of the phosphorylation site of the B-domain, Cys 421. Arg424 of PtsG which is also involved in the stabilization of the phosphate bond is absolutely required for the binding of Mlc.

The determination of the molecular weight of Mlc under native conditions showed that the protein exists as a tetramer. Possibly the C-terminal 18 amino acids of Mlc form an amphipatic -helix. The experiments done in this work showed that the helix has an important function in the formation of the correct tertiary or quaternary structure of the protein. Under native conditions a Mlc-variant which is 18 amino acids shorter solely forms a dimer and has lost the ability to bind to PtsG or to DNA.

In additional binding tests it was found that besides PtsG also YeeI is bound to Mlc. YeeI is a soluble protein which when overproduced, positively influences the expression of the Mlc-controlled genes. It could be demonstrated that YeeI forms a dimer under native conditions. Performing in vitro binding tests it was impossible to detach the Mlc-PtsG-bond even if an excess of YeeI was added.

Likewise a direct protein-protein-interaction between adenylyl cyclase and EIIAGlc could be shown. In contrast to the predominant model that propagates the binding of phosphorylated EIIAGlc, it was dephosphorylated EIIAGlc which was bound. It is unclear if phosphorylated EIIAGlc is bound too. Binding of EIIAGlc to the N-terminal part of the amino terminal catalytic domain of adenylyl cyclase could be detected.

A genome wide search for further Mlc-regulated genes was performed with the help of micro arrays. These data were analysed with the help of reporter gene fusions. Thereby some of the false positive results could be excluded, but up to now no further Mlc-regulated genes could be determined.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Mlc, von Escherichia coli, ist ein globaler, transkriptioneller Regulator, der die Expression verschiedener Systeme zur Aufnahme und Verwertung von Kohlenstoffen repremiert. Die Mlc regulierten Gene werden andererseits durch den cAMP/CAP Komplex aktiviert. Unter den durch Mlc repremierten Genen befinden sich solche, deren Genprodukte Komponenten des PEP abhängigen Phosphotransferasesystems (PTS) darstellen. Die PTS-Komponenten selbst haben ebenfalls regulatorische Funktion. So beeinflusst das EIIAGlc die Aktivität des Enzyms Adenylatcyclase, welches cAMP aus ATP bildet. Mlc selbst wird durch Bindung an PtsG, dem Glukose spezifischen EIICB, inaktiviert. Mlc wird an dephosphoryliertes PtsG gebunden wie man es bei aktiven Transport von Glukose vorfindet. So ist die Bildung des Aktivators cAMP/CAP und die Aktivität des Repressors Mlc im Mlc-PtsG-System in Abhängigkeit von dem Transport von Glukose über PtsG reguliert.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass für die Bindung von Mlc an PtsG, die lösliche, cytoplasmatische B-Domäne von PtsG ausreicht, auch wenn diese unabhängig vom Rest des Proteins als separates Polypeptid exprimiert wird. Jedoch nur, wenn die B-Domäne mittels eines Membranankers membrangebunden ist und der Repressor Mlc dadurch an der Membran fixiert wird, wird zusätzlich eine Derepression der Mlc-regulierten Gene erreicht. Dabei kann IIBGlc an ein Membranprotein fusioniert sein, das keine Ähnlichkeit zur C-Domäne von PtsG hat. Gezeigt wurde zudem, dass Mlc an Bereiche der B-Domäne bindet, die mit der Bindestelle des EIIAGlc überlappen und die sich in unmittelbarer Nähe der Phosphorylierungsstelle der B-Domäne, dem Cys 421, befinden. Das auch an der Stabilisierung der Phosphatbindung beteiligte Arg424 von PtsG ist für die Mlc-Bindung unbedingt erforderlich.

Die Bestimmung des Molekulargewichtes von Mlc ergab, dass das Protein unter nativen Bedingungen als Tetramer vorliegt. Die C-terminalen 18 Aminosäuren von Mlc bilden möglicherweise eine amphipatische -Helix. Die hier durchgeführten Experimente ergaben, dass die Helix eine wichtige Funktion bei der Ausbildung der korrekten Tertiär und Quartiärstruktur des Proteins hat. Eine um die 18 Aminosäuren verkürzte Mlc-Variante bildete unter nativen Bedingungen lediglich ein Dimer und hatte die Fähigkeit verloren an PtsG oder an die DNA zu binden.

In weiteren Bindetests wurde bewiesen, dass Mlc neben PtsG auch an YeeI bindet. YeeI ist ein lösliches Protein, dass bei Überproduktion die Expression der Mlc regulierten Gene positiv beeinflusst. Für YeeI konnte unter nativen Bedingungen die Bildung eines Dimers nachgewiesen werden. In den in vitro Bindetests konnte die Mlc-PtsG-Bindung auch nicht durch Zugabe eines Überschusses an YeeI gelöst werden.

Ebenfalls wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen der Adenylatcyclase und dem EIIAGlc nachgewiesen. Entgegen dem vorherrschenden Modell, das die Bindung von phosphoryliertem EIIAGlc propagierte, erfolgte die Bindung von dephosphoryliertem EIIAGlc. Eine Bindung von phosphoryliertem EIIAGlc konnte weder bewiesen noch ausgeschlossen werden. Für die Bindung von EIIAGlc ist die N-terminale katalytische Domäne der Adenylatcyclase ausreichend.

Eine genomweite Suche nach weiteren Mlc regulierten Genen wurde mit Hilfe von DNA-Microarrays durchgeführt. Durch die nachfolgende Analyse der erhaltenen Daten mittels transkriptioneller Reportergenfusionen, konnten einige der falsch positiven Ergebnisse ausgeschlossen werden, aber keine weiteren Zielgene der Mlc-Regulation ermittelt werden.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
regulator, PTS-system, transport, catobolite repression
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690SEITZ, Sabine, 2005. Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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June 17, 2005
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