Detergent-induced cell aggregation in Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Pseudomonas aeruginosa Stamm PAO1 konnte mit dem toxischen anionischen Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen. Während des Wachstums auf oder in Gegenwart von SDS wurde die Bildung makroskopischer Zellaggregate beobachtet. Diese Aggregate bestanden aus beschädigten und unbeschädigten Zellen, welche in eine Matrix aus sauren Polysacchariden und DNA eingebettet waren. Diese Aggregate wurden gebildet, wenn frei suspendierte Zellen bei hoher Energieversorgung mit SDS versetzt wurden. Dabei aggregierte immer nur ein Teil der Gesamtpopulation. Bei stark limitierter Energieversorgung lysierten die Zellen in Gegenwart von SDS ohne die Bildung von Aggregaten. Diese physiologischen Untersuchungen zeigen, dass SDS toxisch für P. aeruginosa ist und die Bildung von Zellaggregaten einen aktiven und energieabhängigen Prozess darstellt.Aus Kulturen, die mit SDS wuchsen, wurde die nicht aggregierende Spontanmutante Stamm N isoliert. Dieser Stamm bildete glatte Kolonien bei Wachstum auf SDS-haltigen Agarplatten, wohingegen der Wildtyp raue und strukturierte Kolonien auf diesen Medien ausbildete. Aggregation in Flüssigkultur und Bildung rauer Kolonien bei Wachstum mit SDS konnten in Stamm N durch die Expression des Gens PA4929, welches eine putative Guanylatzyklase für die Synthese des Signalmoleküls cyclic di-guanosine monophosphate (c-di-GMP) codiert, wiederhergestellt werden. Die Expression der Phosphodiesterase CC3396 in Stamm PAO1, welche den Abbau von c-di-GMP katalysiert, führte zu einer stark verminderten Aggregation und einem teilweisen Verlust der rauen Koloniemorphologie während des Wachstums mit SDS. Die nicht aggregierenden Stämme N und PAO1[CC3396] wiesen unter starker Energielimitierung eine erheblich geringere Überlebensrate bei der Exposition gegenüber SDS auf. Die Überlebensrate dieser nicht aggregierenden Stämme konnte jedoch durch die Integration von Zellen in die Aggregate von Stamm PAO1 stark erhöht werden. Diese Untersuchungen zeigen, dass die Bildung von Aggregaten keine Voraussetzung für das Wachstum mit SDS ist, jedoch eine erhöhte Überlebensrate unter starker Energielimitierung gewährleistet.Um Gene zu finden, die an der SDS-induzierten Aggregation beteiligt sind, wurde eine Transposonmutagenese durchgeführt. Bei der Mehrzahl der nicht-aggregierenden Transposonmutanten waren zwei Gencluster, das psl- und das cupA Operon, betroffen, welche für die Anheftung von P. aeruginosa an Oberflächen benötigt werden. Das psl Operon kodiert für Proteine, die für die Biosynthese eines extrazellulären Polysaccharids benötigt werden, dessen Monomere vorwiegend aus Mannose und Glucose bestehen. Durch Confocal Laser Scanning Microscopy von Aggregaten, die mit einem spezifischen Lektin gefärbt worden waren, konnten zahlreiche Regionen lokalisiert werden, die Mannose und Glukose enthielten.Das cupA Operon kodiert für Proteine, die für die Bildung adhäsiver Fimbrien benötigt werden. Northern Blot Analysen zeigten eine starke Zunahme des cupA1 Transkriptes in SDS-gewachsenen Zellen von Stamm PAO1 im Vergleich zu Succinat-gewachsenen Zellen. Eine nicht-aggregierende Transposonmutante mit einem Defekt innerhalb des Gens PA0172 zeigte diese Erhöhung des cupA1 Transkriptes nicht. Das Gen PA0172 ist Teil eines Clusters (PA0172-PA0169), dessen Funktion bisher unbekannt war. Durch gezielte Mutation der Gene PA0172 und PA0169 konnte gezeigt werden, dass diese Gene Teil eines putativen c-di-GMP-abhängigen Signaltransduktionswegs sind, der an der transkriptionellen Regulation des cupA Operons beteiligt ist. Sequenzanalysen legen dabei nahe, dass innerhalb eines solchen Signaltransduktionsweges das Genprodukt von PA0172 ein Rezeptor für einen noch unbekannten Reiz darstellt. Die konservierte GGDEF-Domäne des Genprodukts von PA0169 lässt vermuten, dass es sich bei diesem Protein potentiell um eine Guanylatzyklase handelt, die diesen Reiz über das intrazelluläre Signal c-di-GMP weiterleitet. Durch Transkriptionsanalysen wurde die Beteiligung dieser Gene an der transkriptionellen Aktivierung des cupA Operons nachgewiesen. Auch wurden Hinweise gefunden, dass diese Gene zudem an der posttranskriptionellen Stabilisierung der mRNA des cupA Operons beteiligt sind.Die vorliegende Arbeit beschreibt eine neuartige Stressantwort gegenüber toxischen Detergentien, die sowohl physiologisch als auch molekularbiologisch charakterisiert wurde. Dabei konnten durch Identifizierung eines bisher unbekannten Signaltransduktionswegs und dessen Beteiligung an der transkriptionellen Regulation von adhäsiven Oberflächenstukturen neue Erkenntnisse über die komplexen Vorgänge der Aggregation bzw. Biofilmbildung gewonnen werden. Anhand dieser Ergebnisse kann die SDS-induzierte Aggregation einer Teilpopulation als eine adaptive Strategie von Pseudomonas aeruginosa aufgefasst werden, die das Überleben der Gesamtpopulation unter variierenden Umweltbedingungen gewährleistet.