X-ray crystallographic studies on Mlc and Aes, two transcriptional modulators from Escherichia coli

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2005
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X-ray crystallographic studies on Mlc and Aes, two transcriptional modulators from Escherichia coli
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Dissertation
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Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wird die Kristallisation und die Kristallstrukturanalyse von Mlc von Escherichia coli sowie die Kristallisation von Aes von E. coli dargelegt.
Mlc fungiert als Transkriptionsrepressor mehrerer Gene, die für Enzyme des Phosphotransferasesystems (PTS) von E. coli, ptsG und manXYZ, das spezifische Enzym II für die Glukose- und Mannose-PTS-Transporter, sowie für malT, das Gen des globalen Aktivatorproteins des mal Regulons, kodieren (Kapitel 1.4). Die Deaktivierung der Repressoraktivität von Mlc erfolgt durch die Bindung von Mlc an das EIICBGlc Protein des glukosetransportierenden PTS von E. coli. In der vorliegenden Arbeit wird die Klonierung, Reinigung, Kristallisation und Strukturanalyse von Mlc beschrieben. Das mlc Gen wurde mit der Punktmutation R52H in ein pQE Vektor kloniert und das rekombinante Protein konnte danach als selenomethionin-markiertes Protein exprimiert und gereinigt werden. Die Kristallisation des markierten Proteins erfolgte mit der Dampf-Diffusionsmethode. Die Kristalle gehören in die monokline Raumgruppe C2 (Kapitel 2). Die Struktur von Mlc konnte bis zu einer Auflösung von 2.7 Å verfeinert werden (Kapitel 3). Sie die erste Struktur eines Repressorproteins aus der ROK Familie (Kapitel 1.5). Mlc bildet stabile Dimere, eine Beobachtung, die eine Erklärung für die Bindeaffinität von Mlc zu palindromen Operatoren liefert. Die N-terminale Helix-Turn-Helix-Domäne von Mlc wird durch die C-terminale, amphipathische Helix stabilisiert, die mit der Bindung von Mlc an EIICBGlc in Verbindung gebracht wurde (Seitz, S., Lee, S. J., Pennetier, C., Boos, W., and Plumbridge, J. J. Biol. Chem., 278, 10744-10751, 2003). Weiterhin zeigt die Struktur von Mlc eine Metallbindestelle innerhalb des cystein-reichen ROK-Konsensusmotivs 2 (CXCGXXGCXE), welches ein strukturell bedeutendes Zink-Ion koordiniert. Nach der Mutation von zwei der zink-koordinierenden Cystein Reste in Serin bzw. Alanin wurde eine stark geschwächte Repressoraktivität bei Mlc beobachtet. Die Strukturen einer möglichen Fruktokinase von Bacillus subtilis, der Glukokinase von E. coli und einer Glukomannokinase von Arthrobacter sp. zeigen jeweils eine hohe strukturelle Homologie zu dem Bereich von Mlc, der für die ROK Familie spezifisch ist. Der Strukturvergleich dieser drei Proteine führte zu einer neuen Definition der ROK Familie.
Aes von E. coli gehört in die Familie der hormonsensitiven Lipasen (Kapitel 1.7) und hat Acetylesteraseaktivität (Kapitel 1.6). Aes kontrolliert außerdem die Aufnahme von Maltose durch eine direkte Protein-Protein Interaktion mit MalT, dem zentralen Regulator des Maltosesystems von E. coli (Kapitel 1.1). Aes wurde mit einem N-terminalen His6-Tag gereinigt und kristallisiert, sowohl nativ als auch mit Selenomethionin-Markierung. Die nativen Kristalle gehörten in die Raumgruppe R32 bzw. P4x, das markierte Protein kristallisierte in der Raumgruppe R32 (Kapitel 4). Ein nativer Datensatz wurde bei einer Auflösung von 2.4 Å aufgenommen, die Kristalle des selenomethionin-markierten Proteins beugten bis 3.0 Å. Die aufgenommenen Datensätze reichten jedoch nicht aus um die Struktur von Aes lösen zu können.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

This thesis reports the crystallization and the crystal structure analysis of Mlc, a transcriptional repressor protein from Escherichia coli (Chapters 1.4, 2 and 3) and the crystallization of Aes, an acetyl-esterase from E. coli with transcriptional modulator activity (Chapters 1.6 and 4).
Mlc (makes large colonies) from Escherichia coli is a transcriptional repressor controlling the expression of a number of genes encoding enzymes of the Escherichia coli phospho-transferase system (PTS), ptsG and manXYZ, the specific enzyme II for glucose and mannose PTS transporters, as well as malT, the gene of the global activator of the mal regulon. The deactivation of Mlc as a repressor is mediated by binding to an actively transporting PtsG, the EIICBGlc protein of the phosphor-transferase system specific for glucose. In this work the cloning, purification, crystallization and structure solution of Mlc is described. The mlc gene containing the point mutation R52H has been cloned into a pQE vector and the recombinant protein was expressed and purified as the selenomethionine-labeled derivative. Crystallization of the SeMet-Mlc was carried out using the vapour-diffusion method. The crystals obtained belong to the monoclinic space group C2 (Chapter 2). The structure of Mlc at 2.7 Å resolution (Chapter 3) is the first structure of a repressor of the ROK family (Repressors, Open reading frames and Kinases) (Chapter 1.5). Mlc forms stable dimers explaining its binding affinity to the palindromic operator sites. The N-terminal helix-turn-helix domain of Mlc is stabilized by the amphipathic C-terminal helix implicated in EIICBGlc binding earlier (Seitz, S., Lee, S. J., Pennetier, C., Boos, W., and Plumbridge, J. J. Biol. Chem., 278, 10744-10751, 2003). Furthermore, the structure revealed a metal binding site within the cysteine-rich ROK consensus motif 2 CXCGXXGCXE which coordinates a structurally important zinc ion. A strongly reduced repressor activity was observed when two of the zinc-coordinating cysteine residues were exchanged against serine or alanine, demonstrating the role of zinc in Mlc-mediated repressor function. The structures of a putative fructokinase from Bacillus subtilis, the glucokinase from Escherichia coli, and a glucomannokinase from Arthrobacter sp. show high structural homology to the ROK family part of Mlc. The structural comparison of these three proteins led to a new definition of the ROK family.
Aes from Escherichia coli belongs to the family of hormone-sensitive lipases (Chapter 1.7) and has acetyl esterase activity (Chapter 1.6). It is also known to control maltose uptake through an interaction with MalT, the central regulator of the E. coli maltose system (Chapter 1.1). Aes was crystallized as an N-terminally His6-tagged protein, both in the native form (in the space group R32 and in P4x) and with selenomethionine substitution (in the space group R32) (Chapter 4). A native data set has been obtained at 2.4 Å resolution, the selenomethionine-substituted Aes crystals diffracted to 3.0 Å resolution. However, the diffraction data obtained was not sufficient to determine the atomic structure of Aes.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Mlc, Aes, Proteinbindeprotein, Acetylesterase, Histag, Dimer, Tetramer, Monomer, Proteinstruktur, ROK Familie, Glukokinase, NagC, acetyl esterase, ROK family, glucokinase, fructokinase, Escherichia coli, bacteria, PTS (phosphotransferase system), sugar transport
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690GERBER, Kinga, 2005. X-ray crystallographic studies on Mlc and Aes, two transcriptional modulators from Escherichia coli [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Prüfungsdatum der Dissertation
June 14, 2005
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