X-ray crystallographic studies on Mlc and Aes, two transcriptional modulators from Escherichia coli

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wird die Kristallisation und die Kristallstrukturanalyse von Mlc von Escherichia coli sowie die Kristallisation von Aes von E. coli dargelegt.Mlc fungiert als Transkriptionsrepressor mehrerer Gene, die für Enzyme des Phosphotransferasesystems (PTS) von E. coli, ptsG und manXYZ, das spezifische Enzym II für die Glukose- und Mannose-PTS-Transporter, sowie für malT, das Gen des globalen Aktivatorproteins des mal Regulons, kodieren (Kapitel 1.4). Die Deaktivierung der Repressoraktivität von Mlc erfolgt durch die Bindung von Mlc an das EIICBGlc Protein des glukosetransportierenden PTS von E. coli. In der vorliegenden Arbeit wird die Klonierung, Reinigung, Kristallisation und Strukturanalyse von Mlc beschrieben. Das mlc Gen wurde mit der Punktmutation R52H in ein pQE Vektor kloniert und das rekombinante Protein konnte danach als selenomethionin-markiertes Protein exprimiert und gereinigt werden. Die Kristallisation des markierten Proteins erfolgte mit der Dampf-Diffusionsmethode. Die Kristalle gehören in die monokline Raumgruppe C2 (Kapitel 2). Die Struktur von Mlc konnte bis zu einer Auflösung von 2.7 Å verfeinert werden (Kapitel 3). Sie die erste Struktur eines Repressorproteins aus der ROK Familie (Kapitel 1.5). Mlc bildet stabile Dimere, eine Beobachtung, die eine Erklärung für die Bindeaffinität von Mlc zu palindromen Operatoren liefert. Die N-terminale Helix-Turn-Helix-Domäne von Mlc wird durch die C-terminale, amphipathische Helix stabilisiert, die mit der Bindung von Mlc an EIICBGlc in Verbindung gebracht wurde (Seitz, S., Lee, S. J., Pennetier, C., Boos, W., and Plumbridge, J. J. Biol. Chem., 278, 10744-10751, 2003). Weiterhin zeigt die Struktur von Mlc eine Metallbindestelle innerhalb des cystein-reichen ROK-Konsensusmotivs 2 (CXCGXXGCXE), welches ein strukturell bedeutendes Zink-Ion koordiniert. Nach der Mutation von zwei der zink-koordinierenden Cystein Reste in Serin bzw. Alanin wurde eine stark geschwächte Repressoraktivität bei Mlc beobachtet. Die Strukturen einer möglichen Fruktokinase von Bacillus subtilis, der Glukokinase von E. coli und einer Glukomannokinase von Arthrobacter sp. zeigen jeweils eine hohe strukturelle Homologie zu dem Bereich von Mlc, der für die ROK Familie spezifisch ist. Der Strukturvergleich dieser drei Proteine führte zu einer neuen Definition der ROK Familie.Aes von E. coli gehört in die Familie der hormonsensitiven Lipasen (Kapitel 1.7) und hat Acetylesteraseaktivität (Kapitel 1.6). Aes kontrolliert außerdem die Aufnahme von Maltose durch eine direkte Protein-Protein Interaktion mit MalT, dem zentralen Regulator des Maltosesystems von E. coli (Kapitel 1.1). Aes wurde mit einem N-terminalen His6-Tag gereinigt und kristallisiert, sowohl nativ als auch mit Selenomethionin-Markierung. Die nativen Kristalle gehörten in die Raumgruppe R32 bzw. P4x, das markierte Protein kristallisierte in der Raumgruppe R32 (Kapitel 4). Ein nativer Datensatz wurde bei einer Auflösung von 2.4 Å aufgenommen, die Kristalle des selenomethionin-markierten Proteins beugten bis 3.0 Å. Die aufgenommenen Datensätze reichten jedoch nicht aus um die Struktur von Aes lösen zu können.