Ubiquitination via Chemical Ligation between Artificial Amino Acids

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Zusammenfassung

Modification of proteins by the covalent attachment of ubiquitin (Ub) plays a fundamental role in the control of many biological processes including cell cycle regulation, transcription, DNA repair, and apoptosis. Substrate proteins are either mono-ubiquitinated or poly-ubiquitinated, i. e. several Ub monomers are attached to form poly-Ub chains. In these chains several Ub moieties are linked to each other via isopeptide bonds between a specific lysine residue of one Ub and the C-terminal glycine of the next Ub. Ub contains seven lysine residues and each of these lysines can be used for poly-Ub chain formation. Importantly, the actual lysine residue of Ub used for Ub-Ub conjugation seems to determine the biological function of the respective poly-Ub chain.

The aim of the present work was to develop a method to synthesize all naturally occurring Ub dimers and to mono-ubiquitinate substrate proteins in vitro. This will provide the basis to elucidate different functions of differently-linked poly-Ub chains and of mono-ubiquitination.

Cross-linking of Ub to other proteins (either a second Ub or a substrate protein) was achieved using the Cu(I)-catalyzed Huisgen cycloaddition, the so-called click reaction. The two orthogonal functional groups needed for click chemistry, an azide and an alkyne, had to be incorporated into the proteins via artificial amino acids. The azide function was introduced at the C-terminus of one Ub via the methionine analog azidohomoalanine (Aha) using selective pressure incorporation. The alkyne function was introduced via a pyrrolysine analog, the propargyl-protected lysine derivative Plk using amber suppression. It replaced the respective lysine residues naturally used for conjugation. Subsequent click reaction between the two modified proteins resulted in a hydrolytically stable triazole linkage. With this, the synthesis of all seven naturally occurring Ub dimers was possible, as well as the site-specific mono-ubiquitination of the two substrate proteins PCNA and DNA polymerase β.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Ubiquitin (Ub) ist ein kleines, hochkonserviertes Protein, das posttranslational an Substratproteine geknüpft wird. Diese posttranslationale Modifikation spielt eine wichtige Rolle in vielen unterschiedlichen zellulären Prozessen, z. B. bei der Zellzykluskontrolle, der Transkription, der DNA-Reparatur und der Apoptose.
Substratproteine werden dabei entweder mono-ubiquitiniert oder poly-ubiquitiniert, wobei nacheinander mehrere Ub-Monomere angehängt werden, so dass poly-Ub-Ketten entstehen. Die einzelnen Ub-Einheiten innerhalb dieser Ketten sind über Isopeptidbindungen zwischen einem Lysin eines Ubs und dem C-terminalen Glycin eines anderen Ubs verknüpft. Ub enthält sieben Lysine, die alle für die Kettenbildung verwendet werden können. Wichtig ist hierbei, dass die Auswahl des Lysins über die biologische Funktion der jeweiligen Kette zu entscheiden scheint.

Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, die den Aufbau aller sieben möglichen Ub-Dimere und die mono-Ubiquitinierung von Substratproteinen in vitro erlaubt. Damit sollte die Grundlage geschaffen werden, die verschiedenen Funktionen von unterschiedlich verknüpften Ub-Ketten oder von mono-Ubiquitinierungen zu untersuchen.

Die Verknüpfung von Ub mit einem anderen Protein (entweder einem zweiten Ub oder einem Substratprotein) gelang durch die Cu(I)-katalysierte Huisgen Cycloaddition, die sogenannte Click-Reaktion. Die hierfür benötigten orthogonalen Gruppen, ein Azid und ein Alkin, wurden über künstliche Aminosäuren in die Proteine eingebaut. Die Azid-Funktion wurde über das Methioninanalogon Azidohomoalanin (Aha) über die Selective Pressure Incorporation-Methode am C-Terminus eines Ubs eingebaut. Die Alkin-Funktion konnte über das Pyrrolysinanalogon Plk mittels der Amber Suppression-Methode in Proteine eingebracht werden. Es ersetzte jeweils das Lysin, das für die entsprechende natürliche Verknüpfung benutzt wird. In einer nachfolgenden Click-Reaktion wurden die beiden modifizierten Proteine über einen hydrolysestabilen Triazolring verknüpft. Damit gelang die Synthese aller sieben möglichen Ub-Dimere und die ortsspezifische mono-Ubiquitinierung der beiden Substratproteine, PCNA und DNA Polymerase β.

Fachgebiet (DDC)
500 Naturwissenschaften
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Konferenz
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ISO 690EGER, Silvia, 2011. Ubiquitination via Chemical Ligation between Artificial Amino Acids [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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