Publikation: Neue Enzymeigenschaften durch gerichtete Evolution : Entwicklung und Charakterisierung einer thermostabilen Reversen Transkriptase aus einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase
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Through screening of DNA polymerase libraries that contain arbitrary randomized mutants generated by epPCR, we were able to identify enzymes that exhibit RT-PCR function, a function that is imperceptible in the wildtype enzyme. As demonstrated, the identified mutants might find immediate applications and provide the basis for the development of new means for single-step RT-PCR technologies like pathogen RNA detection or gene expression analysis in real time.
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Durch gerichtete Evolution einer thermostabilen DNA-abhängigen DNA-Polymerase wurde eine thermostabile Reverse Transkriptase erhalten. Dies geschah durch Erstellung einer Bibliothek aus mehreren tausend Mutanten der DNA-Polymerase Klentaq durch error prone PCR und anschließendem Screening.
In diesem Ansatz zur Entwicklung einer Reversen Transkriptase wurde die gesamte Bibliothek aus Klentaq DNA-Polymerasen gescreent. Der Vorteil gegenüber anderen Arbeiten, bei denen Polymerasen mit neuen Eigenschaften durch verschiedene Methoden selektiert wurden, liegt in der Simplizität des Systems und in der Übertragbarkeit auf andere Fragestellungen.
Durch Vergleich von Primerverlängerungsreaktionen verschiedener Polymerasen auf einem RNA-Templat wurde die Klentaq DNA-Polymerase als Ausgangsenzym ausgewählt. Die DNA-Sequenz wurde durch eine fehlerbehaftete PCR mit Mn2+ randomisiert. Anschließend wurde sie in den Expressionsvektor pASK-IBA37plus kloniert und eine Bibliothek aus mehreren tausend Varianten erstellt. Diese Bibliothek wurde in E. coli im 96 Loch-Format exprimiert. Die Enzyme wurden unmittelbar nach Lyse und Hitzedena-turierung der übrigen Proteine ohne weitere Reinigung auf ihre PCR-Aktivität mit einem DNA-Templat überprüft. Alle Schritte wurden mit einem Pipettierroboter ausgeführt, der einen hohen Durchsatz ermöglichte.
Die Aktivität der DNA-Polymerasen wurde über das gebildete PCR-Produkt mit Hilfe von SYBR® Green I durch parallele Fluoreszenzmessung in 384-Loch-Platten quantifiziert. Die aktiven Mutanten wurden anschließend auf ihre RT-PCR-Aktivität getestet. Hierzu wurde ein natürliches RNA-Templat aus Bakteriophage MS2 verwendet. Die RT-PCR-Aktivität wurde durch Schmelzkurvenanalyse des PCR-Produkts mit SYBR® Green I quantifiziert, wobei 96-Loch-Platten in einem herkömmlichen Echtzeit-PCR-Gerät ver-wendet wurden.
Nach der Überprüfung von nur 768 PCR-aktiven Mutanten aus ursprünglich 2000 untersuchten Klonen wurde eine Mutante M1 gefunden, die vielversprechende Eigenschaften in der RT-PCR zeigte.
Als nächstes wurde eine zweite Randomisierungsrunde mit ep-PCR, paralleler Expression und anschließendem Screening durchgeführt. Nach Überprüfung von etwa 2000 PCR-aktiven Mutanten wurde ein weiteres aktives Enzym M2 isoliert.
Sowohl M1 als auch M2 waren RT-PCR-aktiv und stellten das gewünschte Produkt her. Die DNA-Aktivität war bei beiden Mutanten etwa doppelt so hoch gegenüber dem Wildtyp, die RNA-Aktivität 40 bzw. 22 mal so hoch. Die untere Grenze an transkribierfähiger RNA liegt im Bereich derer von kommerziellen Kits.
Die Sequenzanalyse der Mutante M1 ergab sechs Substitutionen, die über das gesamte Enzym verteilt sind. M2 wies lediglich eine zusätzliche Mutation auf. Beide Enzyme sind genauso thermostabil wie der Wildtyp, M1 wies aber ein etwa zehnfach höheres Fehlerspektrum auf.
Die in dieser Arbeit entwickelten DNA-Polymerasen mit Reverser Transkriptase-Aktivität haben vor allem zwei Vorteile: Erstens sind sie thermostabil und können also bei Reaktionen mit erhöhter Temperatur eingesetzt werden. Dies erhöht die Primerselektivität, minimiert die Schwierigkeiten durch eventuell vorhandene Sekundärstrukturen der RNA und inhibiert enzymatische Störfaktoren wie RNasen. Zweitens kommen sie ohne Mn2+ aus, was ihr Einsatz in biotechnologischen Anwendungen die cDNA-Synthese ermöglicht.
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ISO 690
SAUTER, Katharina B. M., 2007. Neue Enzymeigenschaften durch gerichtete Evolution : Entwicklung und Charakterisierung einer thermostabilen Reversen Transkriptase aus einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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