Publikation: Der humane MCM4-Genpromoter - eine DNA-Binderegion für Replikationsfaktoren
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Minichromosome maintenance proteins (Mcms) and components of the origin recognition complex (Orc1p - Orc6p) have been detected in all eukaryotes and perform important functions in regulating genome duplication. In this work protein-DNA interactions were studied at a region containing the human MCM4-promoter, located between two divergently transcribed genes MCM4 and PRKDC. Performing nuclease protection experiments six protein binding sites were determined. Four of these binding sites are rich in GC base pairs and could promote the binding of transcription factors Sp1 and AP2. Two more distal sites contain a high percentage of AT base pairs and are not related to the known factor binding sites in databanks. In this genomic region a binding site for human Orc proteins 1 and 2 was identified. For this purpose, chromatin immunoprecipitations were combined with quantitative real-time PCR. Sequences corresponding to the intergenic region are highly abundant in a fraction of nascent DNA strands, strongly suggesting that this region harbors not only the binding sites for Orc1 protein and Orc2 protein, but also serves as an origin of bidirectional DNA replication. This is the first binding region identified in the human genome and, at least in this particular region, ORC could mark the start site for DNA replication in the human genome.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
MCM-Proteine ( Minichromosome maintenance proteins ) und Komponenten des ORC ( origin recognition complex ) bilden in Eukaryoten konservierte Proteinfamilien, die eine essenzielle Funktion bei der Initiation der DNA-Replikation besitzen. In der vorliegenden Dissertation wurde der humane MCM4-Genpromoter, der zwischen den divergent transkribierten Genen MCM4 und PRKDC lokalisiert ist, auf Protein-DNA Interaktionen untersucht. Durch DNase-I-Schutz-Experimente konnten sechs Proteinbindestellen identifiziert werden, von denen vier GC-reich sind und Konsensussequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und AP2 enthalten. Zwei AT-reiche distal gelegene Bereiche, die keine signifikanten Homologien zu Bindemotiven bekannter Transkriptionsfaktoren aufweisen, wurden als potenzielle Binderegion für das hOrc1- und das hOrc2-Protein ermittelt. Für diesen Nachweis wurde eine modifizierte Form der ChIP-Technik (chromatin immunoprecipitation assay) mit quantitativer real-time PCR kombiniert. In Präparationen von naszierender DNA sind die Sequenzen des MCM4-Promoters ebenfalls angereichert. Demnach ist dieser Bereich sowohl eine Binderegion für hOrc1p und hOrc2p als auch eine Startstelle der DNA-Replikation. Damit wurde erstmals eine Binderegion für ORC-Proteine im humanen Genom beschrieben und gezeigt, dass innerhalb dieser speziellen Region der ORC-Komplex Startstellen der DNA-Replikation im humanen Genom markiert.
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ISO 690
LADENBURGER, Eva-Maria, 2002. Der humane MCM4-Genpromoter - eine DNA-Binderegion für Replikationsfaktoren [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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