Characterisation of the proto-oncoprotein DEK

Abstract

DEK wurde 1992 als Bestandteil des Fusionsproteins DEK-CAN entdeckt, in einem Patienten der an Myeloider Leukämie erkrankt war. Dies hat das Interesse an der zellulären Funktion des möglichen 'Proto-Onkogens' DEK geweckt. Es wurden eine Beteiligung am mRNA Metabolismus, an der Transkriptionskontrolle und an der DNA-Reparatur vorgeschlagen; keiner dieser Vorschläge konnte jedoch bisher funktionell bestätigt werden. Die herausragende Fähigkeit von DEK ist es, fixierte, positive Überdrehungen ('supercoils') in DNA einführen zu können. In dieser Arbeit wurden funktionelle Domänen von DEK biochemisch charakterisiert, außerdem wurden verschiedene experimentelle Ansätze verfolgt, um mehr über die zelluläre Funktion von DEK herauszufinden. Die biochemische Charakterisierung bestätigte, dass das evolutiv konservierte Fragment DEK 87-187, welches das DNABox Motiv 'SAP' trägt, tatsächlich DNA-Bindungsaktivität besitzt. Das Fragment fungiert als 'supercoiling' Domäne und reicht aus, die Topologie von DNA zu verändern (Kappes, Scholten et al., eingereicht). Eine zweite DNA-Bindedomäne wurde zwischen den Aminosäuren 270 und 350 gefunden. Diese Region enthält auch eine Multimerisierungsdomäne, die bei der Suche nach Protein- Interaktionspartnern von DEK im Hefe Zwei-Hybrid System gefunden wurde. Mittels 'far Western' Experimenten konnte die Funktion dieser Domäne bestätigt werden. Sowohl DNA-Bindung als auch Multimerisierung werden durch Phosphorylierung moduliert; DNA-Bindung wird inhibiert und Multimerisierung verstärkt. Obwohl DEK in allen bis jetzt untersuchten Zelltypen im Menschen vorkommt, zeigt eine Reduktion der DEK Protein-Menge mittels RNA Interferenz auf unter 15% keinen erkennbaren Phänotyp. Insbesondere wurden keine Hinweise für den berichteten Einfluss von DEK auf die zelluläre Antwort auf DNA Doppelstrangbrüche gefunden, weder nach einem DEK 'knock-down', noch nach einer Überexpression. Immunolokalisationsstudien zeigen, dass DEK an granuläre Substrukturen des Chromatins ('Mikrodomänen') bindet, an die keines der zusätzlich gefärbten nukleären Markerproteine bindet. Im Gegensatz zu früheren Berichten wurde gezeigt, dass sich DEK nicht in Spleißkompartimenten befindet und deswegen vermutlich auch nicht beim Spleißen beteiligt ist. Obwohl die durchschnittliche Aufenthaltsdauer einzelner GFP-DEK Moleküle auf dem Chromatin nur Sekunden beträgt, konnte nachgewiesen werden, dass DEK-Mikrodomänen über mehrere Minuten stabil sind. Phosphorylierung von DEK, welche die Multimerisierung stimuliert, könnte dazu beitragen diese dynamischen Strukturen einzurichten und aufrecht zu erhalten. Es wurde beschrieben, dass DEK die Topologie von DNA verändert. Es könnte allerdings sein, dass die zelluläre Funktion von DEK die eines Sensors ist, der bevorzugt an Orte hoher Torsionsspannungen auf der DNA bindet. Damit könnten andere Faktoren, wie beispielsweise DNA-Reparaturproteine, an die Orte des Geschehens rekrutiert werden.