Charakterisierung des putativen Außenmembran-Proteins TTC0322 von Thermus thermophilus

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Characterization of the putative outer membrane protein TTC0322 of Thermus thermophilus
Forschungsvorhaben
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Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Bachelorarbeit
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Zusammenfassung

The bacterium Thermus thermophilus lives in hot thermal springs and has potential importance for biotechnology, as it contains thermostable proteins.
In this study the characterization of the protein TTC0322 was initiated. Bioinformatical research predicts either a localization in the periplasm or in the outer membrane. Considering the localization on the chromosome, upstream genes encode for an ABCtransporter for glucose and an energizing system like ExbB/ExbD or Tol/Pal. This led to the model of a function of TTC0322 in the active uptake of glucose across the outer membrane. In this model TTC0322 is an active outer membrane transporter for glucose, which is activated by the putative energizing proteins encoded by the three direct upstream genes. To test the model a TTC0322-knockout-mutant was constructed by inserting a bleomycin-resistence-cassette into the gene TTC0322. In a following phenotypically characterization it was found that TTC0322 is essential for growth on glucose, but not for other sugars. Nevertheless, our hypothesis was disapproved, because the knockout-mutant continued transporting glucose. Besides, by knocking out TTC0322, the glucose-ABC-transport-system was constitutively present, which normally is regulated through presence of glucose. That implicates a regulatory effect of TTC0322 on induction. Whether this effect is primarily related to this protein itself or carried out by some second protein influenced through it, was not determined. At this point, a conclusion about the exact role of TTC0322 in T. thermophilus is not possible. Furthermore I tried to express a his-tagged version of TTC0322 in E. coli and T. thermophilus in order to purify it and start some localization studies with it. Low expression only worked in E. coli, whereas T. thermophilus showed no expression, making it impossible to purify the protein or localize it in cellular extracts of T. thermophilus. Additionally there were efforts made to localize the protein by cell-fractionating T. thermophilus wild-type and TTC0322 mutant strains. However, this method was unsuggestive of the localization of TTC0322. By using some bioinformatic research tools extensively in order to find out other hints on this proteins function, it could be shown that the encoding gene isn t necessarily located in one operon with the glucose-ABC-transporter-genes, since another
promoter in front of these genes was found. It might form an own operon, including only additional the genes for the energizing system.
Another interesting observation alongside these experiments is that MalK, which
is known as the ATP-hydrolyzing subunit of both ABC-transporters for glucose and
maltose, might also be part of a so far unknown fructose-ABC-transporter. Experiments showed that a knockout-mutant of malK lost its ability to grow on fructose.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Thermus thermophilus ist ein thermophiles Eubakterium, das in Thermalquellen vorkommt. Aufgrund der Thermophilie und der damit einhergehenden Thermostabilität der Proteine rückt dieses Bakterium immer mehr in das Interesse der biotechnologischen Forschung. In dieser Arbeit soll das bislang nicht näher untersuchte Protein TTC0322 erstmalig charakterisiert werden. Bioinformatische Analysen zu diesem Protein sprechen für eine Lokalisation im Periplasma oder in der Außenmembran. Aufgrund benachbarter Glucose-ABC-Transporter- und Energetisierungs-System-Gene auf dem Chromosom wurde die Hypothese aufgestellt, es könne sich bei TTC0322 um einen Außenmembran-Transporter für Glucose handeln. Durch die Insertion einer thermostabilen Bleomycin-Kassette in das Gen wurde eine Mutante hergestellt, über deren phänotypische Charakterisierung die Hypothese überprüft wurde. Es wurde herausgefunden, dass TTC0322 für Wachstum auf Glucose essentiell ist. Das Modell des Glucose-ABC-Transporters in der Außenmembran konnte jedoch ausgeschlossen werden, da gezeigt wurde, dass das Protein nicht am Glucose-Transport beteiligt ist, da die Mutante weiterhin in der Lage war Glucose zu transportieren. Durch das Ausschalten des Gens kam es dazu, dass der Glc-ABC-Transporter konstitutiv exprimiert wurde, unabhängig davon, ob die Expression der entsprechenden Gene durch die Anwesenheit von Glucose induziert wurde oder nicht. Darüber, ob dieser regulatorische Effekt jedoch direkt oder indirekt durch das Protein TTC0322 ausgeübt wird, kann noch keine Aussage getroffen werden. Die konkrete Funktion von TTC0322 konnte jedoch noch nicht ermittelt werden. Des Weiteren konnte eine mit His-Tag versehene Variante von TTC0322 in E. coli schwach exprimiert werden, während T. thermophilus keine Expression zeigte. Deshalb war es nicht möglich, das Protein aus Zellextrakten von T. thermophilus zu reinigen oder zu lokalisieren. Es wurde zusätzlich parallel über eine Zellfraktionierung von T. thermophilus versucht das Protein zu lokalisieren. Diese Methode war bislang ebenfalls ohne Erfolg. Aufgrund einer erneuten intensiven bioinformatischen Analyse des Gens und der
Lokalisation auf dem Chromosom wird nun davon ausgegangen, dass das Gen nicht
zusammen mit den Genen für den Glc-ABC-Transporter in einem Operon liegt, sondern nur mit den Energetisierungs-System-Genen, da in der chromosomalen Region vor dem putativen Energetisierungs-System ein weiterer Promoter gefunden wurde. Eine weitere wichtige Beobachtung, die im Rahmen der Versuche gemacht wurde ist, dass das Protein MalK, welches die ATP-hydrolysierende Untereinheit des Glc und des Mal-ABC-Transporters darstellt, möglicherweise auch die ATPase eines noch nicht bekannten Frc-ABC-Transporters sein könnte. Schaltet man malK aus, so ist Wachstum auf Fructose nicht mehr möglich.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690PÖLTL, Dominik, 2006. Charakterisierung des putativen Außenmembran-Proteins TTC0322 von Thermus thermophilus [Bachelor thesis]
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