Investigations of Photosystem-II-Mutants in the diatom Phaodactylum tricornutum

Abstract

In dieser Arbeit wurden vier verschiedene Mutanten der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum charakterisiert. Alle Mutationen liegen im D1 Protein des Photosystems II (PS II) und befinden sich innerhalb bzw. in näherer Umgebung der QB-Bindetasche. Ein Aminosäurenaustausch von Valin zu Isoleucin in Position 219 (VI-219), Phenylalanin zu Isoleucin in Position 255 (FI-255), Serin zu Alanin in Position 264 (SA-264) und Leucin zu Tryptophan in Position 275 (LW-275) wurden festgestellt. Neben der genetischen Charakterisierung wurden verschiedene physiologische Messungen durchgeführt, um den Einfluss der Mutationen auf die Photosynthese zu untersuchen. Untersuchungen zur Elektronentransport-Rate und Resistenz gegen DCMU als auch Messungen zur Struktur des photosynthetischen Apparates wurden gemacht. Des Weiteren wurden zwei verschiedene Lichtschutz-Mechanismen untersucht, die die Zellen vor Licht schützen sollen. Diese sind das so genannte non-photochemical fluorescence quenching (NPQ), ein Prozess bei dem überschüssige Energie in Wärme umgewandelt wird sowie der Elektronenzyklus um das PS II. In VI-219 wurde nur eine schwache Minderung des Elektronentransportes von QA nach QB im Vergleich zum Wild-Typ (WT) gemessen und auch die Resistenz gegen DCMU war niedrig (Faktor 3). Die Menge an PS II und die Antennengröße pro PS II Reaktionszentrum unterschieden sich nur geringfügig von den Werten, die für den WT gefunden wurden. Dies galt auch für die NPQ-Werte und den PS II Zyklus. In FI-255 dagegen war die Elektronentransport-Rate um den Faktor 2.7 vermindert. Eine 300-fache Resistenz gegen DCMU wurde festgestellt, sowie eine Zunahme an PS II und eine gleichzeitige Verkleinerung der Antennengröße pro PS II. Die Werte für NPQ waren niedriger als im WT, was einen verminderten Lichtschutz bedeutet. Ein Maximum von etwa 6 Elektronen kreisen hier um das Photosystem II, was dem 1,5 fachen des maximalen PS II Zyklus im WT (4 Elektronen) entspricht. SA-264 war um den gleichen Faktor wie FI-255 im Elektronentransport inhibiert, zeigte aber eine sehr hohe Resistenz gegen DCMU (3000-fach). Wie in FI-255 wurde auch hier eine Zunahme der PS II Reaktionszentren und damit des D1 gemessen sowie eine Verkleinerung der Antennengröße. Die Werte für NPQ sowie für den PS II Zyklus waren sehr gering. In LW-275 konnte die höchste Inhibierung des Elektronentransfers von QA nach QB gemessen werden mit einem Faktor von 1.5. Das bedeutet, dass während im WT 3 Elektronen transportiert werden, können in der LW-275 Mutante in derselben Zeit nur 2 Elektronen weitergereicht werden. Neben der Resistenz gegen DCMU konnte auch hier wie in den Mutanten FI-255 und SA-264 eine Zunahme des PS II und eine Verringerung der Antennengröße beobachtet werden. Ausserdem wurde hier auch die Anzahl an PS I pro PS II erhöht. LW-275 besitzt die niedrigsten Werte für NPQ und hat mit 7 Elektronen die höchste Anzahl an Elektronen, die um das PS II kreisen was auf hohe Lichtempfindlichkeit schließen lässt. Dies konnte in Starklicht Experimenten bestätigt werden.Neben den physiologischen Messungen wurden Vorbereitungen für Gen-Expressionsanalysen durchgeführt. Da die Expression verschiedener Proteine des Chloroplasten, die im Zellkern kodiert sind, vom Redoxzustand des Plastochinon-Pools abhängt, sollten Expressionsanalysen vorbereitet werden. In dieser Arbeit wurden erfolgreich Hybridisierungssonden hergestellt, quantifiziert und getestet.Die hier vorgestellten Mutanten sind die ersten photosynthetischen Mutanten in einer Kieselalge. Durch die Charakterisierung konnten Erkenntnisse über die Bedeutung der vier Aminosäuren im Elektronentransport und im Lichtschutz gewonnen werden. Dabei zeigte sich insbesondere, dass, abgesehen von den Aminosäuren innerhalb bzw. in unmittelbarer Nähe der QB Bindetasche (Pos. 255 und 264), die Aminosäure an der Position 275 eine entscheidende Rolle in der Funktionalität des Photosystems II zu spielen scheint.1. Gutachter (Betreuer): Professor Dr. P. Kroth, Universität Konstanz2. Gutachter: Professor Dr. I. Adamska, Universität Konstanz