Automatisierte Quantifizierung von DNA-Schädigung und DNA-Reparatur und deren Anwendung in der genetischen Toxikologie und Alternsforschung

Abstract

In Vorarbeit war es gelungen, den Fluorometric analysis of DNA unwinding (FADU)-Assay zu automatisieren und mit Hilfe dieses Messverfahrens DNA-Strangbrüche mit einer hohen Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit (0,4 Gy Röntgenstrahlung) zu detektieren (Diplomarbeit Moreno-Villanueva, 2004).In der vorliegenden Arbeit werden nun folgende Sachverhalte beschrieben: (1) eine Verbesserung der Empfindlichkeit auf bis zu 0,16 Gy Röntgenstrahlung; (2) eine Erhöhung des Probendurchsatzes auf das Dreifache; (3) die Validierung des Assays anhand eines breiten Spektrums von chemischen gentoxischen Agenzien mit unterschiedlichen Angriffspunkten; (4) die Optimierung von Protokollen zur Messung von DNA-Schädigung in mitochondrialer DNA bzw. in Vogel-Erythrozyten, (5) die Etablierung experimenteller Bedingungen zur Erfassung der DNA-Reparatur sowie (6) der Vergleich der neuen Methode mit dem bisherigen Goldstandard , dem Comet-Assay.Insbesondere konnte gezeigt werden, dass mit dem verbesserten FADU-Assay DNA-Schäden, die durch sehr niedrige, nicht-zytotoxische Dosen verursacht werden, in mehreren Zellsystemen bereits erfasst werden können. Es wurde außerdem gezeigt, dass sich dieser Assay zur Messung der frühen Phase der DNA-Reparatur besonders gut eignet und dass die DNA-Reparatur durch das Fehlen von fötalem Kälberserum (FCS) bzw. von Zink gehemmt wird. Des weiteren wurden Reparaturexperimente an humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von gesunden Spendern durchgeführt und es wurde dabei nachgewiesen, dass die Reparatur vom Nährmedium abhängt. Es wurde außerdem anhand von Messungen des Reparaturverlaufs in 5-Minuten-Abständen gezeigt, dass der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-Inhibitor 3-Aminobenzamid (3-AB) die DNA-Strangbruch-Reparatur signifikant verzögert. Zuletzt konnte gezeigt werden, dass der FADU-Assay geeignet ist, die zeitliche Überlagerung von DNA-Schädigung und DNA-Reparaturprozessen aufzulösen. Mit den hier erzielten Ergebnisse wird also ein neues, robustes und anwenderfreundliches Werkzeug bereitgestellt, welches breite Einsatzmöglichkeiten für die biologische Grundlagenforschung, die Toxikologie, die Arzneimittelforschung, die Lebensmittelforschung sowie für die Alternsforschung und Präventivmedizin bietet.