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The Role of DNA Repair in the Evolution of Vertebrate Longevity

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In der heutigen Zeit sind Alterungsprozesse und die Evolution von Langlebigkeit mehr denn je ein wichtiges und interessantes Forschungsgebiet. Das Verständnis der molekularen Grundlagen ist dabei die Voraussetzung, um effizient altersbedingte Erkrankungen entgegen treten zu können. Das Hauptaugenmerk des vorliegenden Projektes liegt auf der Poly(ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP1), einem Protein, das unter anderem eingebunden ist in die Regulation der DNA Reparatur, der genomischen Stabilität und Alterung. PARP1 bewirkt die Katalyse einer weitreichenden posttranslationalen, kovalenten Proteinmodifikation, und ist damit die Hauptquelle einer Reaktion, die Poly(ADP-ribosyl)ierung genannt wird. In dieser Reaktion wird das Substrat Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) in Nikotinamid, ein Proton und ADP-Ribose gespalten. Das letztere wird dabei kovalent an ein Akzeptorprotein gebunden, wie beispielsweise Histone oder PARP1 selbst. PARP1 ist in allen eukaryotischen Zellen (außer Hefen) zu finden und ist ein evolutionär stark konserviertes Protein (ungefähr 60 % Übereinstimmung zwischen H.sapiens und D.melanogaster), wobei die Aktivität einer beachtlichen Variation unterliegt. Der Einfluss von DNA Reparaturregulation auf den Alterungsprozess und umgekehrt ist in Säugern hinreichend bekannt, ob dies jedoch in anderen Wirbeltierklassen ebenso ein generelles Alterungsmerkmal ist, wurde bisher nicht untersucht. Rekombinantes PARP1 von unterschiedlichen Fischarten wurde eingesetzt, um in vitro die Korrelation von Enzymaktivität mit der jeweiligen Lebensspanne zu bestimmen. Der Vorteil vieler Fischarten ist, dass sie ebenso wie Säuger differenzierte Gewebe besitzen und organspezifische Anzeichen von Alterung zeigen, im Gegensatz zu anderen Modell-Spezies. PARP1 von Nothobranchius furzeri, einem extrem kurzlebigem afrikanischem Killifisch (ca. 9 Monate), und anderen Nothobranchius-Arten (Lebensspanne bis zu 18 Monaten) wurden in dieser Studie zusammen mit dem Zebrafisch Danio rerio (ca. 42 Monate) und dem Medaka Oryzias latipes (ca. 60 Monate) eingesetzt. Diese Auswahl an unterschiedlichen Fischarten erlaubt die Betrachtung von PARP1 auf einer evolutionär basaleren Ebene. In dieser Arbeit war es möglich, die PARP1 DNA Sequenz der vier untersuchten Nothobranchius-Arten (N.furzeri, N.orthonotus, N.rubripinnis und N.korthausae) zu definieren. Aufgrund des hohen Konservierungsgrades könnte es anhand des Aminosäurensequenzvergleichs möglich werden, die PARP1 Aktivität auf definierte Sequenzabschnitte bzw. einzelne Aminosäuren zurückzuführen. Nachfolgend wurden die rekombinanten Proteine mit Hilfe eines baculoviralen Expressionssystems exprimiert und aufgereinigt. Durch Aktivitätsassays mit anschließenden Slotblots war es möglich die enzymatischen Parameter KM und Vmax zu bestimmen und die Wechselzahl kcat und die katalytische Effizienz kcat / KM zu berechnen. Diese zeigten eine starke Korrelation zur Lebensspanne und untermauert damit die Bedeutung von PARP1 im Alterungsprozess. Die optimale Reaktionstemperatur der Fisch-PARP1s lag zwischen 27 und 30°C. Die Durchführung der Reaktionen bei einer Temperatur von 30°C ermöglichten damit eine Reaktionsdurchführung im optimalen Temperaturbereich und zudem den direkten Vergleich zu Parametern von rekombinantem murinem und humanem PARP1 aus einer Studie von S. Beneke aus dem Jahr 2010. Die Aktivität von PARP1 bei Fischen mit den Lebensspannen von 9 – 60 Monaten scheint im Gegensatz zu humaner PARP1 und PARP1 von Ratten, zu gleichen Teilen abhängig zu sein von der Substrataffinität und der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie

Schlagwörter

DNA Repair, PARP1, Enzyme Activity

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ISO 690GOHM, Birgit, 2016. The Role of DNA Repair in the Evolution of Vertebrate Longevity [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Prüfungsdatum der Dissertation

October 12, 2016
Hochschulschriftenvermerk
Konstanz, Univ., Diss., 2016
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