Isolierung des Proteinkinasegenes snf1 aus Colletotrichum graminicola und ihre Bedeutung für die Pathogenese

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war festzustellen, welche Bedeutung den CWDE bei der Penetration der Maisepidermiszellen während der von Colletotrichum graminicola zu Teil wird. Dieser phytopathogene Ascomycet generiert in melanisierten Appresso-rien Druck zur Unterstützung der Penetration durch die pflanzliche Zellwand in die Epidermiszellen seines Wirtes. Die Kraft die dabei von der Penetrationshyphe auf die Unterlage ausgeübt wird wurde mit 17,5µN bestimmt. Pilze ohne Appressorien sind alleine auf CWDE angewiesen, da sie keinen Druck generieren können. Eine unbe-antwortete Frage war daher die Bedeutung der CWDE für die Pathogenese vonC. graminicola, der Druck zur Penetration nutzt.Experimente in anderen phytopathogenen Pilzen zeigten, mit sehr wenigen Ausnah-men, keine Effekte, wenn einzelne oder mehrere CWDE (bis zu 4 gleichzeitig) durch Deletionsmutationen ausgeschaltet wurden. Der Grund dafür findet sich in der Re-dundanz der CWDE. Wird ein Gen ausgeschaltet, findet man eine ähnliche Enzym-aktivität, die von einem anderen Protein vermittelt wird. Daher wurde vermutet, das es einen universalen Regulator für diese Enzyme gibt, wie er in Saccharomyces mit SNF1 beschrieben wurde. Diese Proteinkinase reguliert die Derepression von durch Glukose reprimierte Enzyme, die für die Erschießung alternativer Kohlenstoffquellen verantwortlich zeigen.Durch die Verwendung degenerierter Primer, die von hoch konservierten Bereichen homologer SNF1-Genen abgeleitet wurden, war es möglich, ein Fragment zu amplifi-zieren, das sukzessive bis auf 2204 bp verlängert wurde. Darin befand sich ein 1743 bp langes offenes Leseraster mit 2 Introns, das insgesamt für ein 580 Aminosäure langes Protein kodierte. 1212 bp der klonierten Sequenz wurden für die Konstruktion eines Knockout-Vektors verwendet, indem eine Hygromycin-Resistenz-Kassette in den translatierten Bereich eingebaut wurde. Nach der Transformation des Wildtyp-Isolates mit diesem Konstrukt wurden 2 Transformanten identifiziert, in denen das Wildtypgen für SNF1 durch eine homologe Rekombination ausgeschaltet worden war und zusätzlich eine Transformante mit einer ektopischen Integration des Deletions-vektors.Bei den durchgeführten Pathogenitätstests zeigte sich, daß die Pathogenese der De-letionsmutanten verzögert und ihre Virulenz verringert war. Bei der mikroskopischen Untersuchung zeigten sich im Vergleich zur Entwicklung des Wildtypisolates morpho-logische Unterschiede: Die Bildung der Appressorien war deutlich vermindert und es konnten keine longitudinal wachsenden Sekundärhyphen beobachtet werden. Da-durch ergab sich eine typische Morphologie der Infektionsstrukturen, die als Infekti-onsstern beschrieben wurde.Enzymatische Untersuchungen der Kulturüberstande der Mutanten, deren einzige Kohlenstoffquelle isolierte Maiszellwände waren, zeigten eine Reduktion der enzy-matischen Aktivitäten von Cellulasen, Xylanasen und Pektinasen.Zytorrhyzieversuche ergaben keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Deletions-mutante, woraus gefolgert wurde, daß es durch die Mutation zu keiner Veränderung der Zusammensetzung der appressorialen Wand gekommen ist.Die Knockout-Mutante wuchs deutlich langsamer auf verschiedenen Kohlenstoffquel-len, wobei es sich sowohl um komplexe Verbindungen wie isolierte Maiszellwände, aber auch monomere Verbindungen handelte.Durch die Verwendung von Agardiffusionstests von Kulturüberständen konnte eine Repression durch Glukose gegenüber cellulolytischen, aber nicht den pektischen Enzymen im Wildtyp demonstriert werden.