Charakterisierung der Rust Transferred Proteins, einer Rostpilz-spezifischen Effektor-Familie

Abstract

Das von Haustorien des Rostpilzes Uromyces fabae sekretierte Rust Transferred Protein 1 (Uf-RTP1p) ist das erste pilzliche Protein, für welches eine Translokation aus der extra-haustoriellen Matrix in das Cytoplasma der Wirtszellen beschrieben wurde (Kemen et al. 2005). Ausgehend von der Uf-RTP1p-Sequenz und der Sequenzen zweier weiterer Homologe aus Uromyces-Arten konnten RTP1p-Homologe in zahlreichen Gattungen der Uredinales identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sich bei den Rust Transferred Proteins um eine Familie von Effektorproteinen handelt, die für die Rostpilze spezifisch ist und dort ubiquitär vorkommt. Die RTPp-Familie gliedert sich in mehrere Untergruppen auf, wobei die meisten untersuchten Rostpilz-Arten RTPp-Vertreter aus verschiedenen Gruppen besitzen. Diese Diversifikation könnte eine Anpassung an unterschiedliche Wirtspflanzen oder pflanzliche Interaktionspartner darstellen.Bei allen Mitgliedern der RTPp-Familie handelt es sich um kleine, sekretierte Proteine mit einem Molekulargewicht von 22 bis 27 kDa. Durch die Analyse der genomischen Struktur, der Aminosäure-Sequenzen sowie auch der Sekundärstruktur konnte gezeigt werden, dass die RTP1p-Homologe ähnlich wie andere Effektorproteine modular aufgebaut sind. Sie bestehen aus zwei Proteindomänen, die sich im Grad ihrer Konservierung und ihrer Struktur deutlich unterscheiden und die somit im Verlauf der biotrophen Interaktion vermutlich verschiedene Funktionen übernehmen.Die kleinere N-terminale Domäne enthält keine Sekundärstruktur-Motive, sondern bildet eine strukturell ungeordnete Region. Die Aminosäuresequenz ist stark variabel und zeigt als einziges konserviertes Element ein Motiv zur posttranslationalen Prozessierung. Dieses ähnelt den Transfer-Motiven intrazellulärer Effektoren von Oomyceten und des Malaria-Erregers Plasmodium falciparum, und ist somit möglicherweise für die Translokation der Proteine ins pflanzliche Cytoplasma verantwortlich.Die C-terminale Domäne der RTP1p-Homologe ist sowohl in ihrer Aminosäure-Sequenz wie auch in ihrer Sekundärstruktur stark konserviert und besteht aus einer Abfolge von sieben β-Strängen, die durch sechs Loops verbunden sind. Zwei der β-Stränge bilden eine bereits für Uf-RTP1p beschriebene β-Aggregationsdomäne. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Bereich für die für das heterolog exprimierte Uf-RTP1p beobachtete Bildung amyloid-ähnlicher Filamente verantwortlich ist. Die Analyse konservierter Cystein-Reste deutet auf eine Stabilisierung der Struktur der C-terminalen Domäne durch Disulfidbrücken hin.Die RTP1p-Homologe zeigen keine Sequenzhomologien zu anderen Proteinen, jedoch bestehen in der Abfolge der beschriebenen Sekundärstrukturmotive und in den dazwischenliegenden Loop-Sequenzen Ähnlichkeiten zur Struktur von Cystein-Protease-Inhibitoren der Chagasin-Familie. Durch die Untersuchung der proteolytischen Aktivität im Kulturüberstand von Pichia pastoris konnte gezeigt werden, dass diese tatsächlich durch Uf-RTP1p und Us-RTP1p gehemmt wird. Die RTP1p-Homologen bilden somit möglicherweise eine neue Familie von Protease-Inhibitoren mit Chagasin-ähnlicher Faltung. Da pflanzliche Proteasen in zahlreichen Prozessen der Pathogenabwehr, auch während der Infektion von Pflanzen durch Rostpilze, eine entscheidende Rolle spielen, könnten die Rust Transferred Proteins somit durch die Manipulation der pflanzlichen Resistenzreaktion über die Hemmung Abwehr-assoziierter Proteasen einen entscheidenden Faktor zur Aufrechterhaltung der biotrophen Interaktion darstellen.