Human Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1-Expressing Embryonic Stem Cells and Mice : Generation and Phenotypic Characterization

Lade...
Vorschaubild
Dateien
Diss_Mangerich.pdf
Diss_Mangerich.pdfGröße: 11.29 MBDownloads: 628
Datum
2008
Autor:innen
Herausgeber:innen
Kontakt
ISSN der Zeitschrift
Electronic ISSN
ISBN
Bibliografische Daten
Verlag
Schriftenreihe
Auflagebezeichnung
DOI (zitierfähiger Link)
ArXiv-ID
Internationale Patentnummer
EU-Projektnummer
DFG-Projektnummer
Angaben zur Forschungsförderung (Freitext)
Projekt
Open Access-Veröffentlichung
Sammlungen
Gesperrt bis
Titel in einer weiteren Sprache
Humane Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1-exprimierende embryonale Stammzellen und Mäuse,Herstellung und phänotypische Charakterisierung
Forschungsvorhaben
Organisationseinheiten
Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
Published
Erschienen in
Zusammenfassung

Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) uses NAD+ as a substrate to modify various nuclear proteins with the biopolymer poly(ADP-ribose), thereby regulating a variety of cellular processes such as DNA repair, gene transcription, and cell death. These diverse functions on the cellular level are also reflected in the contribution of PARP-1 to multiple physiological and pathophysiological conditions on an organismal level.
While several groups have established PARP-1-deficient mice, PARP-1-overexpressing or hypermorphic mice have not been described to date. The latter, however, should also represent a relevant biological model, the rationale being provided by the fact that the poly(ADP-ribosyl)ation capacity of purified human PARP-1 (hPARP-1) is significantly higher than that of its rodent (rat) orthologue. In this thesis, a novel mouse model with ectopic expression of hPARP-1 (comprising two independent congenic lines) was generated, using gene targeting in embryonic stem (ES) cells. The targeting vector was designed to allow replacement of the murine Parp-1 (mParp-1) coding sequence (32 kb) with its human orthologous sequence (46 kb). Unexpectedly though, site-specific homologous recombination was mimicked by bidirectional extension of the vector homology arms, followed by adjacent integration of the targeting vector, thus leaving the murine locus functional. Related to this phenomenon is the so-called ectopic gene targeting mediated by synthesis-dependent strand annealing (SDSA), which has so far only been described for 'ends-in integration vectors in non-ES cell gene targeting. Therefore, results of this thesis give new insight into the role of SDSA during gene targeting and are of general importance for the design of gene knock-in approaches in mice.
Mutant hPARP-1 ES cells and mice displayed gene-dose-dependent expression levels of hPARP-1, thereby resulting in a moderate overexpression of total PARP-1, while mPARP-1 expression was downregulated to some extent. Consequently, hPARP-1 ES cells exhibited an altered poly(ADP-ribosyl)ation metabolism, but an intact DNA damage response. Phenotypic analyses revealed impaired survival rates in a gene-dose-dependent manner in both sexes of hPARP-1 mice, with females being more affected. Several pathologies were identified in hPARP-1 mice, such as obesity, glomerulopathy, and splenomegaly, all pointing to the development of chronic diseases. Moreover, hPARP-1 mice showed signs of premature aging, such as sporadic kyphosis accompanied by alterations in bone metabolism and impaired regenerative potential of the hair.
In conclusion, this study characterized the occurrence of ectopic gene targeting in murine ES cells transfected with an ends-out gene replacement vector for the first time. Furthermore, the generated hPARP-1 mice represent a novel model system with unexpected, multifaceted phenotypes, which should be instrumental for the elucidation of the role of PARP-1 in health and disease.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Das Enzym Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) verwendet NAD+ als Substrat, um etliche Zellkernproteine mit dem Biopolymer Poly(ADP-Ribose) zu modifizieren. Dadurch beeinflusst die PARP-1 eine Vielzahl von zellulären Funktionen, wie z.B. die DNA Reparatur, Gentranskription und Zelltodregulierung. Aufgrund dieser diversen Funktionen auf zellulärer Ebene ist die PARP-1 an mehreren physiologischen sowie pathophysiologischen Prozessen im Organismus beteiligt.
Im Gegensatz zu PARP-1-defizienten Mäusen wurden auf dem Gebiet der Poly(ADP-Ribose) Forschung bislang weder PARP-1 überexprimierende transgene Mäuse noch hypermorphe Mausmutanten beschrieben. Jedoch könnte der Umstand, dass die humane PARP-1 (hPARP-1) im Vergleich zur Nagetier-PARP-1 (Ratte) eine deutlich erhöhte Poly(ADP-ribosyl)ierungskapazität aufweist, dazu ausgenutzt werden, um hypermorphe PARP-1 Knock-in Mäuse zu generieren. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues Mausmodel mit ektopischer Expression der hPARP-1 etabliert. Unter Verwendung der Gene Targeting Technologie in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) wurden dabei zwei unabhängige congene Mauslinien generiert. Das hierbei verwendete Targeting Vektor-Konstrukt sollte einen Austausch der endogenen murinen Parp-1 (mParp-1) kodierenden Sequenz (32 kb) mit der humanen orthologen Sequenz (46 kb) ermöglichen. Unerwarteterweise wurde durch eine intrazelluläre bidirektionale Verlängerung der homologen Vektor-Sequenzen und die anschließende Integration des Vektors in benachbarte chromosomale Bereiche eine ortsspezische homologe Rekombination des Targeting Vektors vorgetäuscht. Folglich blieb der endogene mPARP-1 Genlokus funktionell intakt. Ein ähnliches Phänomen ist als ektopisches Gene Targeting bekannt, welches durch den zellulären Prozess des Synthesis-dependent Strand Annealing (SDSA) vermittelt wird. Dieses ektopische Gene Targeting wurde bislang ausschließlich bei der Verwendung von Ends-in Integrationskonstrukten, und nicht in ES-Zellen beschrieben. Die vorliegende Arbeit vermittelt daher einen Einblick in die Rolle des SDSA während des Gene Targeting Prozesses, was für die Konzeption zukünftiger Gen-Knock-in Strategien in der Maus von allgemeiner Bedeutung ist.
Genetisch veränderte hPARP-1 ES-Zellen und Mäuse exprimierten die hPARP-1 in Abhängigkeit von der hPARP-1-Gen-Dosis. Dies führte zu einer moderaten Überexpression der Menge an Gesamt-PARP-1, wobei die Expression der endogenen mPARP-1 erniedrigt war. Folglich zeigten hPARP-1 ES Zellen einen veränderten Poly(ADP-Ribose) Metabolismus bei gleichbleibender Überlebensrate nach gen-toxischen Stimuli. In Abhängigkeit von der hPARP-1 Gen-Dosis wiesen genetisch veränderte Mäuse eine beeinträchtigte Überlebensrate auf, wobei der Effekt bei Weibchen stärker ausgeprägt war. Mehrere pathologische Veränderungen, insbesondere Adipositas, Glomerulopathie und eine Vergrößerung der Milz, konnten bei hPARP-1 Tieren festgestellt werden, was auf die Ausbildung eines chronisch pathologischen Phänotyps schließen lässt. Diese Hypothese wird gestützt durch Anzeichen auf vorzeitige Alterung bei hPARP-1-exprimierenden Tieren wie dem sporadischen Auftreten einer Kyphose, welche mit Veränderungen des Knochenmetabolismus einherging, sowie einem verminderten regenerativen Fellwachstum.
Die vorliegende Arbeit beschreibt und charakterisiert erstmalig ektopisches Gene Targeting in murinen ES-Zellen, die mit einem Ends-out Genaustauschvektor transfiziert wurden. Weiterhin zeigten die hierbei generierten hPARP-1-expremierende Mäuse unerwartete und vielschichtige phänotypische Veränderungen, welche die Grundlage für ein besseres Verständnis der PARP-1 in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen bilden.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
PARP-1, Transgenic Mouse, Homologous Recombination, DNA Repair, Aging
Konferenz
Rezension
undefined / . - undefined, undefined
Zitieren
ISO 690MANGERICH, Aswin, 2008. Human Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1-Expressing Embryonic Stem Cells and Mice : Generation and Phenotypic Characterization [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
BibTex
@phdthesis{Mangerich2008Human-8520,
  year={2008},
  title={Human Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1-Expressing Embryonic Stem Cells and Mice : Generation and Phenotypic Characterization},
  author={Mangerich, Aswin},
  address={Konstanz},
  school={Universität Konstanz}
}
RDF
<rdf:RDF
    xmlns:dcterms="http://purl.org/dc/terms/"
    xmlns:dc="http://purl.org/dc/elements/1.1/"
    xmlns:rdf="http://www.w3.org/1999/02/22-rdf-syntax-ns#"
    xmlns:bibo="http://purl.org/ontology/bibo/"
    xmlns:dspace="http://digital-repositories.org/ontologies/dspace/0.1.0#"
    xmlns:foaf="http://xmlns.com/foaf/0.1/"
    xmlns:void="http://rdfs.org/ns/void#"
    xmlns:xsd="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#" > 
  <rdf:Description rdf:about="https://kops.uni-konstanz.de/server/rdf/resource/123456789/8520">
    <foaf:homepage rdf:resource="http://localhost:8080/"/>
    <dcterms:abstract xml:lang="eng">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) uses NAD+ as a substrate to modify various nuclear proteins with the biopolymer poly(ADP-ribose), thereby regulating a variety of cellular processes such as DNA repair, gene transcription, and cell death. These diverse functions on the cellular level are also reflected in the contribution of PARP-1 to multiple physiological and pathophysiological conditions on an organismal level.&lt;br /&gt;While several groups have established PARP-1-deficient mice, PARP-1-overexpressing or hypermorphic mice have not been described to date. The latter, however, should also represent a relevant biological model, the rationale being provided by the fact that the poly(ADP-ribosyl)ation capacity of purified human PARP-1 (hPARP-1) is significantly higher than that of its rodent (rat) orthologue. In this thesis, a novel mouse model with ectopic expression of hPARP-1 (comprising two independent congenic lines) was generated, using gene targeting in embryonic stem (ES) cells. The targeting vector was designed to allow replacement of the murine Parp-1 (mParp-1) coding sequence (32 kb) with its human orthologous sequence (46 kb). Unexpectedly though, site-specific homologous recombination was mimicked by bidirectional extension of the vector homology arms, followed by adjacent integration of the targeting vector, thus leaving the murine locus functional. Related to this phenomenon is the so-called  ectopic gene targeting  mediated by synthesis-dependent strand annealing (SDSA), which has so far only been described for 'ends-in  integration vectors in non-ES cell gene targeting. Therefore, results of this thesis give new insight into the role of SDSA during gene targeting and are of general importance for the design of gene knock-in approaches in mice.&lt;br /&gt;Mutant hPARP-1 ES cells and mice displayed gene-dose-dependent expression levels of hPARP-1, thereby resulting in a moderate overexpression of total PARP-1, while mPARP-1 expression was downregulated to some extent. Consequently, hPARP-1 ES cells exhibited an altered poly(ADP-ribosyl)ation metabolism, but an intact DNA damage response. Phenotypic analyses revealed impaired survival rates in a gene-dose-dependent manner in both sexes of hPARP-1 mice, with females being more affected. Several pathologies were identified in hPARP-1 mice, such as obesity, glomerulopathy, and splenomegaly, all pointing to the development of chronic diseases. Moreover, hPARP-1 mice showed signs of premature aging, such as sporadic kyphosis accompanied by alterations in bone metabolism and impaired regenerative potential of the hair.&lt;br /&gt;In conclusion, this study characterized the occurrence of ectopic gene targeting in murine ES cells transfected with an  ends-out  gene replacement vector for the first time. Furthermore, the generated hPARP-1 mice represent a novel model system with unexpected, multifaceted phenotypes, which should be instrumental for the elucidation of the role of PARP-1 in health and disease.</dcterms:abstract>
    <dc:format>application/pdf</dc:format>
    <dcterms:available rdf:datatype="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#dateTime">2011-03-24T17:44:21Z</dcterms:available>
    <dcterms:rights rdf:resource="https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/"/>
    <dcterms:issued>2008</dcterms:issued>
    <dcterms:alternative>Humane Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1-exprimierende embryonale Stammzellen und Mäuse</dcterms:alternative>
    <dc:creator>Mangerich, Aswin</dc:creator>
    <dc:rights>terms-of-use</dc:rights>
    <dcterms:isPartOf rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/server/rdf/resource/123456789/28"/>
    <dspace:hasBitstream rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/bitstream/123456789/8520/1/Diss_Mangerich.pdf"/>
    <dc:contributor>Mangerich, Aswin</dc:contributor>
    <dc:language>eng</dc:language>
    <bibo:uri rdf:resource="http://kops.uni-konstanz.de/handle/123456789/8520"/>
    <dcterms:title>Human Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1-Expressing Embryonic Stem Cells and Mice : Generation and Phenotypic Characterization</dcterms:title>
    <dspace:isPartOfCollection rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/server/rdf/resource/123456789/28"/>
    <dcterms:alternative>Herstellung und phänotypische Charakterisierung</dcterms:alternative>
    <dcterms:hasPart rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/bitstream/123456789/8520/1/Diss_Mangerich.pdf"/>
    <dc:date rdf:datatype="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#dateTime">2011-03-24T17:44:21Z</dc:date>
    <void:sparqlEndpoint rdf:resource="http://localhost/fuseki/dspace/sparql"/>
  </rdf:Description>
</rdf:RDF>
Interner Vermerk
xmlui.Submission.submit.DescribeStep.inputForms.label.kops_note_fromSubmitter
Kontakt
URL der Originalveröffentl.
Prüfdatum der URL
Prüfungsdatum der Dissertation
July 14, 2008
Finanzierungsart
Kommentar zur Publikation
Allianzlizenz
Corresponding Authors der Uni Konstanz vorhanden
Internationale Co-Autor:innen
Universitätsbibliographie
Ja
Begutachtet
Diese Publikation teilen