Enzymatic Synthesis of Functionalized DNA

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2010
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Enzymatische Synthese von modifizierter DNA
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Dissertation
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Zusammenfassung

In conclusion, the synthesis of several triphosphates with different modifications at the C5 position of the nucleobase was developed. In enzyme catalysed reactions I was able to find conditions whereby functionalised nucleotides can act as surrogate for natural nucleotides. The triphosphates synthesised in the first part of this work were functionalised with polyethylene glycol monomethyl ether residues or with polyamido dendrons bearing different end groups. Highly modified DNA fragments were generated by primer extension and PCR employing the described modified nucleotides. These modified DNA fragments were used to investigate the influence of the modifications on DNA properties. Thus, I was able to establish a method to generate DNA fragments that are grafted with linear polyethylene glycol monomethyl ethers or branched polyamido dendrons leading to entities with high molecular weight, modification density and structural accuracy.
In the second part of this work, I was able to establish the synthesis of nucleotides harbouring a DNA strand (up to 38 nucleotides) at the nucleobase. These DNA building blocks were used successfully to introduce an additional DNA strand with a free 3’-OH in a nascent primer strand by primer extension. By this method highly branched DNA is feasible by enzyme-mediated reactions. I was able to find conditions to use the incorporated DNA strands as primer in primer extension or rolling circle amplification. This method was enhanced and transferred successful on DNA microarrays. With these findings the eligibility of these nucleotides as diagnostic tool was evidenced.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

In dieser Arbeit wurde die Synthese verschiedener Triphosphate mit unterschiedlichen Modifikationen and der C5 Position entwickelt. In enzym-vermittelten Reaktionen konnte ich Bedingungen finden mit denen der vollständige Ersatz der natürlichen Nukleotide durch die modifizierten Bausteine möglich war. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Triphosphate mit Polyethyleneglykolmonomethylethern oder mit wasserlöslichen Polyamidodendronen mit verschiedenen Endgruppen funktionalisiert. Durch den Einsatz dieser Nukleotide wurden hoch modifizierte DNA Fragmente durch Primer Verlängerungsreaktionen oder durch Polymerase Kettenreaktionen erzeugt. Diese hoch modifizierten Fragmente wurden verwendet um den Einfluss der Modifikationen auf die Eigenschaften der DNA zu untersuchen. Zudem, konnte ich eine Methode etablieren um DNA Fragmente zu erzeugen die mit linearen Polyethyleneglykolmonomethylethern oder mit verzweigten Polyamidodendronen modifiziert sind. Diese modifizierten DNA Fragmente besitzen ein hohes Molekulargewicht, eine hohe Modifikationsdichte und strukturelle Präzision.
Im zweiten Teil der Arbeit, wurden Nukleotide mit einem DNA Oligomer and der Nukleobase synthetisiert. Diese DNA Bausteine wurden erfolgreich in Primer Verlängerungsreaktionen eingesetzt. Es wurden sowohl Einzeleinbauexperimente als auch Mehrfacheinbauexperimente erfolgreich durchgeführt. Diese Methode ermöglicht die erste enzymatische Synthese stark verzweigter DNA.
Ich konnte Bedingungen finden die es ermöglichten den eingebauten DNA Strang als Primer in Primer Verlängerungsreaktionen als auch bei der Amplifikation unter Verwendung eines zirkulären Templats verwendet werden. Dieser Ansatz konnte erfolgreich auf DNA Microarrays übertragen werden. Mit diesen Resultaten konnte die Eignung dieser Nukleotide als diagnotisches Mittel bewiesen werden.

Fachgebiet (DDC)
540 Chemie
Schlagwörter
modifizierte Nukleotide, funktionalisierte DNA, DNA Hybridmaterialien, DNA Barcode label
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690BACCARO, Anna, 2010. Enzymatic Synthesis of Functionalized DNA [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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December 15, 2010
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