Synthesis of spin-labeled carbohydrates for the investigation of lectins and synthesis of carbasugars as activators for the glmS riboswitch

Seitz, Torben

Synthesis of spin-labeled carbohydrates for the investigation of lectins and synthesis of carbasugars as activators for the glmS riboswitch

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Seitz_0-292174.pdf(11.64 MB)

Date

2015

Publication type

Dissertation

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Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Verwendung von spinmarkierten Kohlenhydraten für die Untersuchung von Lektinen mittels Elektronenspinresonanz(EPR)-Spektroskopie weiterentwickelt. Mittels eines enzymgekoppelten Lektinbindungstests (ELLA) konnte gezeigt werden, dass die Anbringung des Spinlabels in der 6-Position der GlcNAc-Reste keinen negativen Einfluss auf die Bindungsaffinität der Liganden hat. Es wurde eine Serie von verschiedenen spinmarkierten divalenten GlcNAc Liganden synthetisiert, um deren Bindungsmodus an Weizenkeimagglutinin (WGA) in Abhängigkeit von der Ligandkonzentration zu untersuchen. Die verschiedenen spinmarkierten Liganden unterschieden sich dabei in der verwendeten Linkerlänge. Mit diesen Liganden führte Patrick Braun von der Arbeitsgruppe Drescher Bifrequenz-cw-EPR-Experimente durch, um die mikroskopische effektive Molarität (EM) experimentell zu bestimmen. Für alle Liganden wurde in der Konzentrationsspanne, die mittels EPR Spekroskopie zugänglich ist (EM über 1.6 mM), ausschließlich chelatisierendes Binden detektiert. Ein Nachteil der Anbringung von Spinlabeln in der 6-Position der GlcNAc-Reste besteht in der großen Flexibilität des Spinlabels durch die frei rotierbare Methylengruppe der 6-Position. Dies verhindert exakte Abstandsmessungen mittels „double electron electron resonance“ (DEER oder PELDOR) Messungen und führt zu breiten Abstandsverteilungen. Daher wurden in dieser Arbeit verschiedene konformativ eindeutige spinmarkierte Kohlenhydrate synthetisiert. Dabei wurde das Spinlabel über eine C-glycosidische Bindung an die 1-Position der Kohlenhydrate angebracht. Dadurch konnten schärfere Abstandsverteilungen in DEER-Experimenten erreicht werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Suche nach neuen antibiotischen Wirkstoffen, die andere Stoffwechselwege inhibieren als die bereits auf den Markt befindlichen, um so antibiotische Resistenzen zu umgehen. Ein vielversprechender Stoffwechselweg in gramnegativen Bakterien wird dabei vom glmS Riboswitch gesteuert. Der glms-Riboswitch schneidet sich nach der Bindung von Glucosamin-6-phosphat (GlcN6P) selbst, was letzen Endes zur Abnahme der Konzentration an UDP-GlcNAc führt, das für die Zellwandsynthese des Bakteriums essentiell ist. Die Synthese von Molekülen, die den glms-Riboswitch aktivieren können, könnte daher Antibiotika gegen multiresistene Bakterien liefern. In vorangegangen Studien konnte gezeigt werden, dass Carbaglucosamin-6-phosphat (CGlcN6P), bei dem der Ringsauerstoff durch eine Methylengruppe ausgetauscht wurde, den glmS-Riboswitch von S. aureus in einem in vitro-Test fast genauso gut aktivierte wie das natürliche Substrat GlcN6P. Daher wurde in dieser Arbeit CGlcN6P als Ausgangsverbindung verwendet um Substituenten in der Carba-Position einzuführen. Diese Substituenten sollten durch zusätzliche hydrophobe Wechselwirkungen mit den Nucleobasen der glmS-Aptamerdomäne eine erhöhte Bindungsaffinität aufweisen. Die entsprechenden Derivate sollten in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Mayer aus Bonn in in vitro und in vivo Tests auf ihre glmS Ribozymaktivität getestet werden. Die erste Synthesestrategie ging von Glucosamin(GlcN)-Derivaten aus, um in einer Ferrier-Umlagerung als Schlüsselreaktion Substituenten in der Carba-Position einzuführen. Die Einführung einer Acetoxygruppe in der Carba-Position war zwar erfolgreich allerdings scheiterte die weitere Umsetzung zum Carbazucker. In einer zweiten Syntheseroute wurde von -D-Methylmannosid ausgegangen. Hier führte die Verwendung einer Butan-1,2-diacetal Schutzgruppe zu einem einzigen Stereoisomer nach der Ferrier-Umlagerung und sehr guten Ausbeuten. Zudem war die weitere Umsetzung dieses Mannose-Derivates in einer Corey-Chaykovsky-Reaktion mit anschließender Epoxidöffnung möglich. Der Mannose-Carbazucker konnte zudem in zwei zusätzlichen Stufen in einen Carbazucker, der sich von der Glucose ableitet, umgewandelt werden. In Zukunft kann diese Synthesroute verwendet werden, um CGlcN6P-Derivate mit Modifikationen in der Carba-Position zu synthetisieren, die eine höhere Spezifizität hinsichtlich des glmS-Riboswitch besitzen, um so eine neue Klasse von Antibiotika zugänglich zu machen.

Subject (DDC)

540 Chemistry

Keywords

WGA, EPR, carbohydrates, spin-labels, carbasugars, glmS riboswitch

Cite This

ISO 690

SEITZ, Torben, 2015. Synthesis of spin-labeled carbohydrates for the investigation of lectins and synthesis of carbasugars as activators for the glmS riboswitch [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

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Examination date of dissertation

April 30, 2015

University note

Konstanz, Univ., Doctoral dissertation, 2015