The role of Not4 in cellular homeostasis during proliferation and differentiation in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Der eukaryotische Ccr4-NOT Komplex stellt eine multifunktionale, regulatorische Plattform – durch die Kontaktierung einer Vielzahl an Komponenten der Proteinbiosynthesemaschinerie – und beeinflusst die raumzeitliche und kontextspezifische Kontrolle der Genexpression. Er begleitet mRNAs von ihrer transkriptionellen Synthese, über ihre Translation, bis hin zu ihrem Abbau. Der Komplex integriert dabei Reize aus der Umwelt und wirkt sich entsprechend auf die Antwort auf der Ebene der Genexpression aus. Der Ccr4-NOT Komplex besteht aus neun Kernkomponenten, welche um das Gerüstprotein Not1 arrangiert sind. Funktionell kann der Komplex in zwei Hauptbestandteile unterteilt werden: das Deadenylase- und NOT-Modul. Das Deadenylasemodul umfasst die Komplexpartner Caf1 und Ccr4 und ist für die Deadenylierung von mRNAs verantwortlich, welche letztendlich den Abbau von mRNAs initiiert. Im Gegensatz dazu ist das NOT-Modul hauptsächlich an der transkriptionellen Repression beteiligt und besteht aus Not2 bis Not5. Zusätzlich umfasst das NOT-Modul die E3 Ubiquitin-Ligase Not4, welche spezifisch mit den E2-Enzymen Ubc4/5 interagiert und die substratspezifische Konjugation von Ubiquitin vermittelt. Der Komplex ist hochgradig konserviert in seiner strukturellen Organisation, und der ihm innewohnenden Fähigkeiten in Bezug auf molekulare Funktionen und biologische Prozesse. Der Komplex wird seit über 25 Jahren intensiv untersucht und konnte in dieser Zeit sein enormes Potential als zentraler Drehpunkt innerhalb der kontextspezifischen Kontrolle der Genexpression zeigen. Er ist an der Feinsteuerung der Genexpression bei Stressreaktionen und Entwicklungsprozessen beteiligt, wie auch am zellulären Gleichgewicht unter physiologischen Bedingungen. Die Charakterisierung der Einzelkomponenten des Ccr4-NOT Komplexes in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird hauptsächlich mit Hilfe entsprechender Deletionsmutanten durchgeführt, mit Ausnahme von Not1, welches als einzige Untereinheit essenziell ist. Die hier vorgestellte Arbeit befasst sich hauptsächlich mit der E3 Ubiquitin-Ligase Not4 in der Bäckerhefe, und seinem orthologen Verwandten NTL-4 im Fadenwurm Caenorhabditis elegans. Sie trägt mit den folgenden Erkenntnissen zu dem komplexen Regulationsnetzwerk, innerhalb dessen der Ccr4-NOT Komplex seine Aktivitäten ausführt, in einem Not4-spezifischen Umfang bei:1. Obwohl die Deletion von NOT4 von der Bäckerhefe toleriert wird, treten sporadisch Kolonien auf, welche in der Lage sind, Wachstumsphenotypen zu unterdrücken. Deswegen wurde nach einem alternativen Ansatz gesucht, um einen Not4-spezifischen Funktionsverlust untersuchen zu können. Dabei hat sich der kontrollierbare Abbau des Proteins als geeignete Alternative erwiesen, und kann die meisten Phänotypen, die für eine NOT4 Deletion beschrieben wurden, reproduzieren.2. In einer Microarray-basierten Analyse der Gesamt-mRNA wurden teilweise Unterschiede für Not4-dezimierte Zellen im Vergleich zu einer veröffentlichten ähnlichen Untersuchung in NOT4-deletierten Zellen festgestellt. Dabei unterschied sich der Umfang differenziell exprimierter Gene qualitativ und quantitativ. Diese Beobachtung erlaubt eine aufschlussreiche Unterscheidung zwischen unverzüglichen Effekten aufgrund des kurzfristigen Verlusts von Not4 im Vergleich zu langfristigen und möglicherweise akkumulierenden Effekten bezüglich des Gesamttranskriptoms. Zusätzlich lieferte die Microarray-basierte Analyse einen neuen Ansatzpunkt, welcher die beschriebene Derepression von paarungsassoziierten Genen in NOT4-deletierten Zellen erklären könnte. Die unerwartete Genexpression des alpha-Pheromons des entgegengesetzten Hefegeschlechts in Not4-dezimierten Zellen könnte zu einer autokrinen Stimulation des MAPK-vermittelten Paarungssignalweges und dadurch zur Aktivierung entsprechender Gene führen. Die autokrine Stimulation würde hierbei zu einer Aktivierung der Genexpression führen, im Gegensatz zu einer bloßen Derepression durch den Verlust der Not4 Funktion.3. Die Funktion von Not4 ist nicht essenziell für die Umprogrammierung des Transkriptoms und der translationalen Repression aufgrund eines Aminosäureentzugs, jedoch beeinträchtigt sein Verlust global die Effizienz, mit welcher diese Prozesse ablaufen. Dies kann sich kritisch auf das Überleben der Zellen auswirken. Interessanterweise konnte durch Polysomenprofile, welche ein Maß für die globale Translation darstellen, gezeigt werden, dass Not4-dezimierte Zellen unter aminosäurereichen Bedingungen größere Unterschiede zu Kontrollzellen aufwiesen als unter aminosäurearmen Bedingungen. In diesem Zusammenhang ergab sich, dass die Funktion von Not4 unter vorteilhaften Bedingungen für die Förderung der Translation erforderlich ist.4. Während die phänotypischen Auswirkungen in Not4-dezimierten Zellen mit denen einer vollständigen Gendeletion verglichen wurden, wurde ein bisher unbeschriebener Phänotyp für den Funktionsverlust von Not4 entdeckt: invasives Wachstum. Überraschenderweise war dieser Phänotyp von einem der beiden Hefegeschlechter abhängig und trat nur in Zellen mit dem MATa Geschlecht auf. Jedoch ist dieser Phänotyp mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Nebeneffekt der autokrinen Stimulation des Paarungssignalweges, welche für Not4-dezimierte Zellen beobachtet wurde.5. Erste Ergebnisse der Untersuchung des orthologen ntl-4 in C. elegans erlaubten es, Aussagen über die Lokalisierung des Proteins im vollständig entwickelten Wurm zu treffen. Am offensichtlichsten war die Verteilung von NTL-4 innerhalb der Gonaden, was auf eine Beteiligung an der Oogenese schließen lässt und insgesamt in das Bild einer regulatorischen Teilname des Ccr4-NOT Komplexes an Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen passt. Innerhalb der Zellen konnte NTL-4 zweifelsfrei im Zytoplasma detektiert werden, sowohl gleichmäßig verteilt, als auch deutlich konzentriert in Punkten. Der RNA-Interferenz-vermittelte Knock-down von ntl-4 ergab keinen signifikanten Effekt bezüglich der Überlebensrate adulter Würmer. Stattdessen zeichnete sich ein Entwicklungsdefekt ab, welcher durch das häufige Auftreten einer ausgestülpten Vulva (protruding vulva) angezeigt wurde, ausgelöst durch eine Beeinträchtigung der strukturellen Integrität dieses Sexualorgans. Die Häufigkeit, mit welcher dieser Phänotyp auftrat, konnte auf normale Level reduziert werden, indem die RNA-Interferenz erst zu einem Zeitpunkt angewandt wurde, zu dem die Entwicklung bereits abgeschlossen war. Dieser Umstand betont eine Beteiligung von NTL-4 während der Entwicklung erneut.6. Für den Glutamin-/Asparagin-reichen C-Terminus von NTL-4 konnte mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Prionen-ähnliche Domäne vorhergesagt werden, da die Proteinsequenz eine hohe Ähnlichkeit mit Sequenzen aufweist, welche charakteristisch für Proteine, die Prione oder ähnliche Strukturen bilden, sind. Ferner wurde festgestellt, dass sich das Protein mit Hilfe des biotinylierten Isoxazol präzipitieren lässt. Das eröffnet neue vielversprechende Möglichkeiten für weitere Untersuchungen von NTL-4. Not4 lässt sich in ähnlicher Weise präzipitieren, obwohl das Vorhersageprogramm keine hohe Wahrscheinlichkeit für eine Prionen-ähnliche Domäne erkennen ließ. Außerdem konnte das Präzipitationsverhalten von Not4 durch eine Verkürzung an einem seiner beiden Enden signifikant beeinflusst werden.