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X-ray crystallographic studies on bacterial proteins involved in active membrane transport : MalFGK2, MalE, ProX, and AcrB

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2004

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Schiefner, André

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Röntgenkristallographische Untersuchungen von bakteriellen Proteinen, die am aktiven Membrantransport beteiligt sind: MalFGK2, MalE, ProX, and AcrB
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
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Zusammenfassung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Strukturen von verschiedenen Proteinen bestimmt, die am aktiven Transport über bakterielle Membranen beteiligt sind. Bei der Mehrzahl dieser Proteine handelt es sich um Teile von bindeprotein-abhängigen ABC importern. Ein weiteres ist ein Exporter, der an der Resistenzbildung von Bakterien gegen Antibiotika beteiligt ist. ABC transporter stellen die größte Familie homologer Transportproteine dar. Bislang wurden Vertreter dieser Familie in allen näher untersuchten Organismen gefunden. Es ist daher von allgemeinem Interesse, wie diese Transportsysteme funktionieren. Trotz großer Fortschritte auf diesem Gebiet, innerhalb der letzten Jahre, ist der genaue Transportmechanismus noch nicht aufgeklärt. Der erste Teil der Arbeit war auf die Bestimmung der Struktur eines intakten binde-protein-abhängigen ABC transporters gerichtet. Hierfür wurde der Trehalose/Maltose transporter MalFGK2 aus dem hyperthermophilen Archaeon Thermococcus litoralis ausgewählt. Dieser zeichnet sich gegenüber seinem gut studierten Homologen MalFGK2 aus Escherichia coli dadurch aus, dass er bei 85 °C sein Aktivitätsoptimum hat. Erwartungsgemäß sind solche Proteine oder Komplexe bei Raumtemperatur weniger flexibel, wodurch sie sich eher für Kristallisationsversuche eignen. Die besten Kristalle, die innerhalb der Doktorarbeit erhalten wurden, beugten nur bis 5 A, was nicht ausreicht um eine atomare Struktur zu berechnen. Desweiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit die atomaren Strukturen von drei Bindeproteinen aus drei verschiedenen Organismen aufgeklärt. In diesem Zusammenhang konnten neue Erkenntnisse darüber gewonnen werden, wie Bindeproteine an spezifische Aufgaben und Gegebenheiten angepasst sind. MalE aus Alicyclobacillus acidocaldarius wurde untersucht, um seine Säure- und Hitzestabilität zu verstehen. Da das Gram-positive Bakterium A. acidocaldarius gewöhnlich unter recht extremen Bedingungen, wie pH 3.6 and 57 C optimal wächst, müssen all seine nicht-cytoplasmatischen Proteine, die sowohl hohen Temperaturen als auch dem niedrigen pH des extrazellulären Milieus ausgesetzt sind, so angepaßt sein, daß sie optimal arbeiten können und auf längere Sicht keinen Schaden nehmen. Im Vergleich mit MalE-Homologen aus Bakterien und Archaea stellte sich heraus, dass vor allem die Zahl der geladenen Reste auf der Proteinoberfläche reduziert ist. Und obwohl die Zahl der positiv und negativ geladenen Reste ungefähr gleich ist, so sind doch erheblich mehr positiv geladene exponiert. Daraus resultiert eine positive Oberflächenladung, die wahrscheinlich zur Säurestabilität beiträgt. Ein besonderes Interesse, im Rahmen dieser Arbeit, wurde der hochaffinen Bindung von compatiblen Soluten durch Bindeproteine gewidmet. Compatible Solute, wie die quaternären Ammoniumverbindungen Glycin Betain und Prolin Betain, zeichnen sich dadurch aus, dass sie nicht direkt mit Proteinoberflächen wechselwirken können. Das ermöglicht es, Zellen diese Verbindungen zu sehr hohen Konzentrationen anzureichern, ohne damit gleichzeitig Struktur und Funktion ihrer Proteine zu beeinträchtigen. Vielmehr wirkt sich die resultierende nicht-gleichförmige Verteilung compatibler Solute innerhalb der Zelle sogar stabilisierend auf die Struktur von Proteinen aus. Um zu verstehen, wie es Bindeproteinen dennoch möglich ist, compatible Solute mit hoher Affinität zu binden, wurden die Strukturen von ProX aus Escherichia coli und ProX aus Archaeoglobus fulgidus aufgeklärt. Es stellte sich heraus, daß aromatische Aminosäureseitenketten, wie die von Tryptophan und Tyrosin, in einer definierten räumlichen Anordnung diese Aufgabe erfüllen können. ProX aus E. coli wechselwirkt mit der positive Ladung des quaternären Amins durch drei Tryptophanseitenketten, die annäherd rechtwinkligig zueinander orientiert sind. Sehr ähnlich, aber in räumlich veränderter Anordnung, erfolgt die Bindung compatibler Solute durch ProX aus A. fulgidus. Diesmal sind es nicht Tryptophanseitenketten, sondern Tyrosine und ein Hauptkettensauerstoff, die an der Bindung des quaternären amins beteiligt sind. In beiden Fällen wird die Bindung durch eine Kombination aus Kation-pi Wechselwirkung und nicht-klassischen Wasserstoffbrücken vermittelt. Der letzte Teil der vorliegenden Arbeit konzentrierte sich auf strukturelle Untersuchungen, des Multi-Medikamenten Transporters AcrB aus E. coli, der maßgeblich an der Resistenzbildung pathogener Gram-negativer Bakterien beteiligt ist. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Qualität des existierenden AcrB-Modells und die Lokalisierung von Substratenbindestellen durch die Bestimmung von AcrB-Substratkomplexen. Obwohl das AcrB Modell verbessert werden konnte, erscheint seine Qualität immer noch nicht ausreichend, um irgendeine Substratbindestelle lokalisieren zu können.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

This thesis reports several crystal structures of proteins involved in active transport across bacterial membranes. The majority of the proteins are parts of binding protein-dependent ABC importers but one them is an exporter, which is involved in resistance formation of bacteria against antibiotics. ABC transporters form the largest family of homologous transport proteins. Representatives of this family have been found in all investigated organisms. Therefore, it is of general interest, how those transport systems work. Although good progress has been made in the field within the last years, the molecular mechanism of transport is not completely understood. The focus of the first part of the presented work was directed on the structural determination of an intact binding protein-dependent ABC transporter. For this purpose the trehalose/maltose transporter MalFGK2 from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus litoralis has been chosen. This is distinguished from its well studied homologue MalFGK2 from E. coli by its optimum of activity at 85°C. Thermophilic proteins or complexes are expected to be less flexible at room temperature, making them more suitable for crystallization. However, the best crystals obtained during this doctoral work diffracted only to a resolution of 5 A, which is not sufficient to determine the atomic structure. Furthermore, in the context of the work, the atomic structures of three binding proteins from three different organisms have been determined. Thereby new insights have been gained as to how binding proteins are adapted to specific tasks and conditions. MalE from Alicyclobacillus acidocaldarius was studied in order to understand its acido- and thermostability. Since the Gram-positive bacterium A. acidocaldarius usually grows optimally under fairly extreme conditions as pH 3.6 and 57 °C, all of its non-cytoplasmic proteins, which are exposed to high temperatures as well as low pH, have to be adapted to work optimally without being damaged over a longer period of time. Compared to MalE homologues from non-acidophilic bacteria and archaea it turned out that above all the number of charged residues is reduced on the protein surface. Although the number of positively and negatively charged residues is almost the same, substantially more positively charged residues are exposed. The resulting positive surface charge likely contributes to the acidostability. In the context of this work special attention was payed on the high affinity binding of compatible solutes by binding proteins. Compatible solutes, like the quaternary ammonium compounds glycine betaine and proline betaine, are characterized by their property to be excluded from protein surfaces. This property enables cells to accumulate high concentrations of these compounds without affecting structure and function of their proteins at the same time. Furthermore, the resulting non-uniform distribution of compatible solutes within the cell has stabilizing effects on the structure of proteins. To understand, what enables binding proteins to bind compatible solutes with high affinity, the structures of ProX from Escherichia coli and of ProX from Archaeoglobus fulgidus have been determined. It turned out that aromatic side chains like those of tryptophan and tyrosine in a defined sterical arrangement can perform this task. ProX from E. coli interacts with the positive charge of the quaternary amine by three tryptophan side chains which are approximately perpendicularly oriented to each other. In ProX from A. fulgidus a similar architecture is found but with different sterical features. There are no tryptophan side chains but tyrosines and a main chain oxygen involved in the binding of the quaternary amine. In both cases the binding is mediated by a combination of cation-pi interactions and non-classical hydrogen bonds. The last part of the presented work concentrated on structural investigations of the multi-drug transporter AcrB from E. coli that is instrumentally involved in the formation of resistances in pathogenic Gram-negative bacteria. The major goal of this work was to improve the quality of the existing AcrB model and the localization of substrate binding sites by the structural determination of AcrB-substrate complexes. Although the AcrB model has been improved its quality still seems to be not sufficient to localize any substrate binding sites.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie

Schlagwörter

Glycinbetain, Prolinbetain, active transport, binding protein-dependent ABC-transporter, compatible solutes, multi-drug efflux, structure analysis

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Rezension
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Zitieren

ISO 690SCHIEFNER, André, 2004. X-ray crystallographic studies on bacterial proteins involved in active membrane transport : MalFGK2, MalE, ProX, and AcrB [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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July 22, 2004
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