Publikation: Das menschliche Chromatin-assoziierte DEK-Protein : funktionelle Domänen und Phosphorylierung
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In der vorliegenden Arbeit wurden drei experimentelle Ansätze gewählt, um neue Einblicke in die Biochemie des DEK-Proteins zu erhalten.
Untersuchungen der DEK-Expression ergaben gleichmäßige mRNA-Mengen und eine einhergehende, gleichbleibende Neusynthese im HeLa-Zellzyklus. Dies bestätigt frühere Arbeiten, die eine gleichbleibende DEK-Menge während des ganzen Zellzyklus gezeigt haben. DEK wurde weiterhin als stabiles Protein identifiziert, das eine durchschnittliche Aufenthaltsdauer von 20 Stunden in der Zelle aufweist.
In EMSA-Studien mit DEK-Deletionsmutanten konnte zum einen gezeigt werden, dass ein Fragment, das die SAF-Box enthält (87-187), für die DNA-Bindung und Topologieveränderung verantwortlich ist. Zum anderen wurde eine neue, zweite DNA-Bindedomäne identifiziert, die im C-terminalen Bereich (270-350) des DEK-Proteins lokalisiert ist. Die beiden DNA-Bindedomänen unterscheiden sich in der Art der DNA-Bindung maßgeblich voneinander. Dieser Bereich konnte ebenfalls als DEK-Multimerisierungsdomäne identifiziert werden und hat folglich eine duale Funktion.
Studien der DEK-Phosphorylierung zeigten, dass DEK während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert wird, wobei das Maximum in der G1-Phase zu finden ist. Als hauptverantwortliche Kinase konnte die Protein-Kinase CK2 in vitro und in vivo identifiziert werden. Eine Kartierung der CK2-Phosphorylierungsstellen in der DEK-Aminosäuresequenz, ergab, dass sich die meisten Phosphorylierungsstellen im C-terminalen Bereich des Proteins befinden. Dies wurde durch massenspektrometrische Untersuchungen von rekombinantem His-DEK in vitro gefunden. Die Relevanz dieses Befundes wurde durch die Identifizierung von Phosphopeptiden in vivo, die mit den CK2 Stellen überlappen, erweitert.
Die CK2-Phosphorylierung ist maßgeblich an der Regulation der DEK-Aktivitäten beteiligt. So unterscheidet sie zwischen DNA-Bindung und DEK-Multimerisierung. Dies wurde besonders anschaulich im Falle des bifunktionellen Bereiches 270-350 gezeigt. Ein allgemein inhibitorischer Effekt auf die DEK-DNA-Bindung des wt-Proteins konnte durch die Phosphorylierung beobachtet werden. Ein Modell der Regulation der DEK-Funktion durch die Phosphorylierung konnte aufgestellt werden.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
In this dissertation three experimental outlines were chosen to gain more insights into the biochemistry of the abundant chromatin associated DEK protein.
Studies on DEK expression in HeLa cells revealed unvarying amounts of DEK mRNA present throughout the entire cell cycle. This was found to coincide with the new synthesis of DEK, which occurred also in same levels during the cell cycle. These findings confirmed earlier findings, which showed unvarying DEK protein amounts in the HeLa cell cycle. Furthermore, DEK was identified as a stable protein with a half life of approximately 20 hours in a HeLa cell.
EMSA studies, using different DEK deletion mutants showed on the one hand that a fragment, carrying the SAF box (87-187) is responsible for DNA binding and the DEK induced change in topology of DNA substrates. On the other hand a second DNA binding domain was newly identified in the C-terminal part of the protein (aa 270-350). The both DNA binding domains of DEK show different kinds of DNA binding activities. Moreover the C-terminal part was identified as a multimerization domain and has thus dual functions.
Studies on DEK phosphorylation showed that DEK is phosphorylated throughout the entire cell cycle with a peak in G1 phase in vivo. The protein kinase CK2 was identified to be responsible for the main DEK phosphorylation observed in vitro and in vivo. The sites of CK2 phosphorylation within the DEK sequence were mapped through a mass spectrometric approach and were found to be clustered in the C-terminal region of DEK. This was shown by using recombinant his-DEK. These findings were extended by the identification of phosphopeptides in vivo which matched the phosphorylation sites found in vitro. Further investigation revealed that phosphorylation of DEK is involved in the regulation of DEK activities and establishes a hierarchy inbetween DNA binding and multimerization of DEK. This was clearly shown for the bi-functional region 270-350. Furthermore an overall inhibitory effect of DNA binding was observed upon phosphorylation. A model for a possible regulation of DEK activities by phosphorylation was put up from the results obtained in this work.
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ISO 690
KAPPES, Ferdinand, 2004. Das menschliche Chromatin-assoziierte DEK-Protein : funktionelle Domänen und Phosphorylierung [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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