Transformation des obligat biotrophen Rostpilzes Uromyces fabae

Abstract

Rostpilze, die Hauptvertreter der Basidiomyceten, sind obligat biotrophe Parasiten und stellen weltweit eine wichtige Gruppe von Phytopathogenen an wirtschaftlich bedeutenden Kulturpflanzen dar. Der Rostpilz Uromyces fabae wurde als Modellorganismus intensiv erforscht, um zytologische, biochemische und molekulare Vorgänge während der Interaktion mit der Wirtspflanze Vicia faba aufzuklären. Die Untersuchung wichtiger molekularer Vorgänge in obligat biotrophen Pilzen wird jedoch aufgrund der Tatsachen erschwert, dass erstens diese Organismen in künstlichen Medien nicht kultivierbar sind und keine authentische Wirt-Pathogen-Interaktion in vitro hergestellt werden kann sowie zweitens kein universell funktionierendes System für eine stabile Transformation von obligat biotrophen Pilzen existiert. Moderne genetische Methoden wie Überexpression, Silencing oder Tagging von Genen sind daher nicht anwendbar.Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden, Biolistik und Agrobacterium tumefaciens mediierter Transformation (ATMT), eine transiente Transformation von U. fabae erreicht und eine Basis für ein stabiles Transformationssystem geschaffen. Es wurde ein Set von Plasmiden erstellt, welche Farb- und/oder Fungizidmarker zur Selektion tragen, die unter die Kontrolle von endogenen regulatorischen Elementen gesetzt wurden. Promotor- und Terminator-Elemente von Uf-PMA1 (U. fabae Plasmamembran ATPase) wurden benutzt, um die Expression der Farbmarker iGFP (intron green fluorescent protein) und DsRed (red fluorescent protein) sowie des Fungizidmarkers mut-SucDH1 (mutierte Succinat-Dehydrogenase) zu kontrollieren.Die erfolgreiche Transformation mit den Fluoreszenzfarbmarkern iGFP und DsRed in vitro wurde durch die subzelluläre Lokalisierung der DsRed-NLS Expression in den Zellkernen eindeutig bewiesen.Als Fungizidmarker wurden Punktmutationen in die Uf-SucDH1 (H254Y für Plasmidkonstrukt pRV111 und H254L für pRV113) und Uf-TBB1 (E198A) eingefügt, welche die Resistenz gegen die Fungizide Carboxin und Benomyl vermitteln. Für die Expression von Uf-TBB1(E198A) wurde der gesamte genomische Bereich mit endogenen regulatorischen Elementen verwendet. Die beiden Fungizide konnten erfolgreich für eine Selektion der Transformanten in planta etabliert werden. Mit dem angepassten Selektionsschema konnten wichtige Parameter für die ATMT ermittelt werden, sowie durch Verwendung von drei Agrobacterium-Stämmen die Faktoren optimiert werden, die eine Erhöhung der Transformationseffizienz gewärleisten. Mittels Biolistik oder Agrobakterien transformierte Uredosporen konnten somit in großer Anzahl als Transformantenlinien erzeugt und über mehrere Generationen in planta propagiert werden.Bei der Biolistik wurde für die Plasmide pRV111 (tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1) und pRV113 (H254L) eine Transformationseffizienz von 7,1 x 10-5 bzw. 5,3 x 10-5 erreicht. Bei der ATMT konnte mit dem gleichen Transgen je nach verwendetem Agrobacterium Stamm eine Effizienz von 3,6 x 10-5 (AGL-1), 2,5 x 10-5 (GV3103) und 1,4 x 10-5 (LBA1100) erzielt werden. Molekulare Analysen der potentiell transformierten Uredosporen ergaben unterschiedliche Nachweise der Transformation, basierend auf der Amplifikation der Gen-Kassette und schließlich dem Nachweis der Punktmutation und damit einer wahrscheinlichen Integration der transgenen SucDH1(H254Y).