Publikation: Identification and characterization of type III-secreted chlamydial pathogenicity factors and their impact on the infected host cell
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Zusammenfassung
Chlamydophila pneumoniae ist ein obligat intrazelluläres, gram-negatives Humanpathogen, welches Lungenentzündungen verursacht und als Risikofaktor für Krankheiten wie Artheriosklerose, Herzkranzgefässerkrankungen und Alzheimer diskutiert wird. Während des gesamten intrazellulären Lebenszyklus sind die Chlamydien von einer Vakuole aus Wirtszellmembran, einer sogenannten Inclusion, umgeben. Der spezielle Lebenszyklus ermöglicht es dem Pathogen in den klinisch problematischen Zustand der Persistenz überzugehen in welchem die Chlamydien nicht antibiotisch bekämpfbar sind. Daher besteht die grosse Herausforderung für die Pharmaindustrie darin, spezifische antichlamydiale Antibiotika zu entwickeln, die auch in der Lage sind persistente Infektionen zu bekämpfen. Da Chlamydien bekanntermassen ein Typ III Sekretionssystem (T3SS) besitzen, könnte man durch Studieren dieses speziellen Sekretionsapparats für Virulenzfaktoren zu neuen Targets für die Entwicklung antichlamydialer Antibiotika kommen.
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von potentiellen, Typ III-sezernierten Virulenzfaktoren von C. pneumoniae, sowie die Charakterisierung deren Wirkmechanismen in der Wirtszelle.
Acht Kandidatengene wurden aus dem Genom von C. pneumoniae Stamm TW183 ausgewählt. Sekretion von sechs der ausgewählten Kandidatenproteine, CopN, cpMip, Pkn5, CpB0736, CpB0739 und CpB0856 konnte mit Hilfe von Immunzytochemie nachgewiesen werden. Alle sechs Kandidaten wurden in die Inclusionsmembran hinein sezerniert. Es wurde gezeigt, dass sowohl die Expression wie auch die Sekretion dieser chlamydialen Effektorproteine zeitlich reguliert wird. Das bedeutet, dass verschiedene Virulenzfaktoren ihre jeweilige Rolle zu unterschiedlichen Zeiten des Infektionszyklus ausüben. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass individuelle Inclusionen innerhalb einer Wirtszelle bezüglich der Sekretion der Virulenzfaktoren autonom sind.
In dieser Arbeit wurde ein Modell vorgeschlagen, worin die Sekretion der Virulenzfaktoren in die Inclusionsmembran diese Proteine in der direkten Umgebung der Inclusionen bindet und dadurch ein lokales Mikrokompartiment schafft, welches Wachstum, Teilung und Überleben der Chlamydien in dieser spezialisierten Nische ermöglicht. Durch die Lokalisierung der sezernierten Effektorproteine in der Inclusionsmembran sind diese in der Lage mit Proteinen im Zytoplasma der Wirtszelle zu interagieren.
Zwei der sezernierten Effektorproteine, Pkn5 und cpMip, wurden genauer charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass Pkn5 (CpB0730), ein Serin-Threoninkinase-ähnlicher Effektor, zwar nicht selbst als Kinase aktiv ist, aber dennoch in der Lage ist, die Phosphorylierung von Wirtszellproteinen wie des Rho GDP Dissoziations-Inhibitorproteins (RhoGDI), einer Proteindisulfid-Isomerase (PDI) sowie einer regulatorischen Untereinheit der Proteinkinase A TypI zu beeinflussen. Sowohl Pkn5 als auch CpB0739, die beide 20 hpi (Stunden nach Infektion) sezerniert werden, könnten einen Einfluss auf die Remodellierung des Zytoskeletts der Wirtszelle haben. Pkn5 induzierte die Phosphorylierung von RhoGDI durch Wirtszellkinasen in Kinaseassays. Es ist bekannt, dass die Phosphorylierung von RhoGDI die Aktivität von Rho Proteinen beeinflusst, welche wiederum an der Strukturierung des Zytoskeletts der Wirtszelle beteiligt sind. CpB0739 besitzt eine Adenylatzyklase-Domäne, die über zyklisches AMP ebenfalls das Wirtszell-Zytoskelett beeinflussen könnte. Die Hemmung der Phosphorylierung der PDI und der regulatorischen Untereinheit von PKA durch Pkn5 könnte zur Induktion von Interleukin-10 führen, welches die Wirtszelle vor Apoptose schützt. Die posttranslationale Modifikation von Pkn5 mit SUMO1 Protein, verursacht durch das Wirtszellprotein PIASx, wurde hier ebenfalls gezeigt. PIASx konnte mittels Immunzytochemie auf der Oberfläche der Inclusionen lokalisiert werden.
Die hier gezeigten Ergebnisse machen deutlich, dass die Infektion mit C. pneumoniae TW183 weder den NFkB noch die STAT1, STAT2 oder STAT3 Signaltransduktionswege beeinflusst.
Es wurde demonstriert, dass das Effektorprotein cpMip eine essentielle Rolle in der Chlamydieninfektion spielt. Die Hemmung der peptidyl prolyl cis-trans Isomeraseaktivität von cpMip durch die immunsupprimierende Substanz FK506 hatte einen hemmenden Einfluss auf die Infektion mit C. pneumoniae. In dieser Arbeit wird vorgeschlagen, dass sich eine Substruktur des grossen FK506 Biomoleküls als Leadstruktur für die Entwicklung spezifischer antichlamydialer Antibiotika eignen könnte.
Weitere Untersuchungen der sezernierten Effektorproteine und deren intrazellulärer Funktion sind nötig. Die hier berichtete Identifizierung und Charakterisierung von Typ III-sezernierten Effektorproteinen von C. pneumoniae zusammen mit der Untersuchung ihres Einflusses auf die Pathogen-Wirt Interaktion ist ein Schritt in Richtung der Entwicklung potenterer antichlamydialer Antibiotika.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
Chlamydophila pneumoniae is an important, obligate intracellular, gram-negative human pathogen, responsible not only for lung infections but also discussed as a risk factor for a wide range of diseases like Atherosklerosis, Coronary artery disease and Alzheimer s disease. Throughout their intracellular life cycle Chlamydia stay enclosed within a host cell membrane vacuole, termed an inclusion. The special life cycle enables this pathogen to go into a persistent state of infection, which is clinically problematic, since it cannot be eradicated with current antibiotics. The challenge for the Pharma industry is to develop specific antichlamydial antibiotics, which are potent enough to also eradicate these persistent infections. Therefore it is necessary to learn more about this pathogen, as well as about pathogen-host interactions. Since Chlamydia have been reported to possess a type III secretion system (T3SS), studying this specialized secretion device for virulence factors could result in new targets for the development of antichlamydial antibiotics.
The objective of this work was to identify putative virulence factors of C. pneumoniae, secreted by the T3SS, and to characterize their mode of action in the host cell.
Eight candidate genes were selected from the C. pneumoniae strain TW183 genome sequence. Secretion of six of the respective candidate proteins could be demonstrated with Immunocytochemistry. These were CopN, cpMip, Pkn5, CpB0736, CpB0739 and CpB0856. Secretion of all six putative chlamydial virulence factors was shown to occur into the inclusion membrane. The timely regulation of expression and secretion of these chlamydial effector proteins was shown. This implies that different virulence factors fulfil their roles during different times of the infection cycle. Furthermore it was demonstrated that individual inclusions within a host cell are autonomous with respect to secretion of the virulence factors. This indicates that regulation of secretion occurs individually for each inclusion.
A model was proposed in this work, where secretion of virulence factors into the inclusion membrane keeps these proteins within the direct surrounding of the inclusions and thereby might create a local microenvironment, which allows Chlamydia to grow, multiply and survive within this specialized niche. Localization of secreted effector proteins within the inclusion membrane enables Chlamydia to interact with proteins in the host cell cytoplasm.
Two of the secreted effector proteins, Pkn5 and cpMip, were investigated in closer detail. Pkn5 (CpB0730), a Serine-Threonine kinase-like effector was demonstrated to possess no kinase activity itself but to influence the phosphorylation of host cell proteins. Affected host cell proteins were a Rho GDP dissociation inhibitor (RhoGDI), a protein disulfide isomerase (PDI) and a regulatory subunit of protein kinase A type I. Pkn5 and CpB0739, both being secreted at 20 hpi (hours post-infection), might influence host cell cytoskeletal remodelling. Pkn5 induced the phosphorylation of RhoGDI by host cell kinases in kinase assays. Phosphorylation of RhoGDI was described to influence Rho activity, which is involved in cytoskeletal rearrangement. CpB0739 has an adenylate cyclase domain, which might also influence the host cell cytoskeleton via cyclic AMP. Inhibition of the phosphorylation of PDI and PKA regulatory domain by Pkn5 could lead to induction of Interleukin-10 expression, which in turn inhibits host cell apoptosis. Pkn5 furthermore was shown to be posttranslationaly modified with SUMO1, mediated by host cell PIASx. Localization of PIASx on the surface of chlamydial inclusions was demonstrated with Immunocytochemistry.
The herein reported results indicate that infection with C. pneumoniae TW183 neither affects the NFkB nor the STAT1, STAT2 or STAT3 signal transduction pathways.
Secreted effector protein cpMip was shown to be essential for C. pneumoniae infection. Inhibition of its intrinsic peptidyl prolyl cis-trans isomerase activity by the immunosuppressive drug FK506 also inhibited the progress of the infection with C. pneumoniae. It was proposed in this work, that a substructure of the huge FK506 biomolecule could be used as lead structure for the development of specific antichlamydial antibiotics.
Further analysis of the secreted effector proteins and their intracellular functions is necessary. The herein reported identification and characterization of type III-secreted effector proteins of C. pneumoniae together with the investigation of their impact on pathogen-host interaction is one step towards the development of more potent antichlamydial antibiotics.
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HERRMANN, Michael, 2004. Identification and characterization of type III-secreted chlamydial pathogenicity factors and their impact on the infected host cell [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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Sekretion von sechs der ausgewählten Kandidatenproteine, CopN, cpMip, Pkn5, CpB0736, CpB0739 und CpB0856 konnte mit Hilfe von Immunzytochemie nachgewiesen werden. Alle sechs Kandidaten wurden in die Inclusionsmembran hinein sezerniert. Es wurde gezeigt, dass sowohl die Expression wie auch die Sekretion dieser chlamydialen Effektorproteine zeitlich reguliert wird. Das bedeutet, dass verschiedene Virulenzfaktoren ihre jeweilige Rolle zu unterschiedlichen Zeiten des Infektionszyklus ausüben. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass individuelle Inclusionen innerhalb einer Wirtszelle bezüglich der Sekretion der Virulenzfaktoren autonom sind.<br />In dieser Arbeit wurde ein Modell vorgeschlagen, worin die Sekretion der Virulenzfaktoren in die Inclusionsmembran diese Proteine in der direkten Umgebung der Inclusionen bindet und dadurch ein lokales Mikrokompartiment schafft, welches Wachstum, Teilung und Überleben der Chlamydien in dieser spezialisierten Nische ermöglicht. Durch die Lokalisierung der sezernierten Effektorproteine in der Inclusionsmembran sind diese in der Lage mit Proteinen im Zytoplasma der Wirtszelle zu interagieren.<br />Zwei der sezernierten Effektorproteine, Pkn5 und cpMip, wurden genauer charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass Pkn5 (CpB0730), ein Serin-Threoninkinase-ähnlicher Effektor, zwar nicht selbst als Kinase aktiv ist, aber dennoch in der Lage ist, die Phosphorylierung von Wirtszellproteinen wie des Rho GDP Dissoziations-Inhibitorproteins (RhoGDI), einer Proteindisulfid-Isomerase (PDI) sowie einer regulatorischen Untereinheit der Proteinkinase A TypI zu beeinflussen. Sowohl Pkn5 als auch CpB0739, die beide 20 hpi (Stunden nach Infektion) sezerniert werden, könnten einen Einfluss auf die Remodellierung des Zytoskeletts der Wirtszelle haben. Pkn5 induzierte die Phosphorylierung von RhoGDI durch Wirtszellkinasen in Kinaseassays. Es ist bekannt, dass die Phosphorylierung von RhoGDI die Aktivität von Rho Proteinen beeinflusst, welche wiederum an der Strukturierung des Zytoskeletts der Wirtszelle beteiligt sind. CpB0739 besitzt eine Adenylatzyklase-Domäne, die über zyklisches AMP ebenfalls das Wirtszell-Zytoskelett beeinflussen könnte. Die Hemmung der Phosphorylierung der PDI und der regulatorischen Untereinheit von PKA durch Pkn5 könnte zur Induktion von Interleukin-10 führen, welches die Wirtszelle vor Apoptose schützt. Die posttranslationale Modifikation von Pkn5 mit SUMO1 Protein, verursacht durch das Wirtszellprotein PIASx, wurde hier ebenfalls gezeigt. PIASx konnte mittels Immunzytochemie auf der Oberfläche der Inclusionen lokalisiert werden.<br />Die hier gezeigten Ergebnisse machen deutlich, dass die Infektion mit C. pneumoniae TW183 weder den NFkB noch die STAT1, STAT2 oder STAT3 Signaltransduktionswege beeinflusst.<br />Es wurde demonstriert, dass das Effektorprotein cpMip eine essentielle Rolle in der Chlamydieninfektion spielt. Die Hemmung der peptidyl prolyl cis-trans Isomeraseaktivität von cpMip durch die immunsupprimierende Substanz FK506 hatte einen hemmenden Einfluss auf die Infektion mit C. pneumoniae. In dieser Arbeit wird vorgeschlagen, dass sich eine Substruktur des grossen FK506 Biomoleküls als Leadstruktur für die Entwicklung spezifischer antichlamydialer Antibiotika eignen könnte.<br />Weitere Untersuchungen der sezernierten Effektorproteine und deren intrazellulärer Funktion sind nötig. 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