Taurin und Ciliatin als Stickstoffquellen für Bakterien

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2004
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Taurine and ciliatine as nitrogen sources for bacteria
Publikationstyp
Masterarbeit/Diplomarbeit
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Zusammenfassung

Der Abbau von Taurin als Stickstoffquelle wurde in Rhodopseudomonas palustris CGA009 untersucht. Es wurde bestätigt, dass der Organismus während der Assimilation des Taurin-Stickstoffs die stabile C-Sulfonat-Bindung unangetastet ließ und ein Organosulfonat, nämlich Sulfoacetat, bildete und ausschied. Die erste Reaktion dieses Abbauweges führt von Taurin zu Sulfoacetaldehyd und wird vermutlich von einer Taurin-Dehydrogenase, welche auf genetischer Ebene nachgewiesen werden konnte, katalysiert. Eine induzierbare, NAD+-abhängige Sulfoacetaldehyd-Dehydrogenase katalysiert den zweiten Schritt, bei dem Sulfoacetaldehyd zu Sulfoacetat umgesetzt wird. Diese Bildung von Sulfoacetat aus Taurin ist äußerst interessant, da bisher die pflanzliche Sulfoquinovose als einzige Quelle für Sulfoacetat angesehen wurde. Die Reaktion der Sulfoacetaldehyd-Dehydrogenase wurde daher näher charakterisiert und das Enzym teilweise gereinigt.
Die Verbreitung der verschiedenen möglichen Wege zum Abbau von Taurin als Stickstoffquelle wurde durch Anreicherungskulturen untersucht, durch welche neun Reinkulturen gewonnen wurden. Die Bildung von Isethionat sowie von Sulfoacetaldehyd stellten mit je knapp der Hälfte die am häufigsten auftretenden Möglichkeiten dar, während der zuvor einzig bekannte Weg, nämlich die Ausscheidung von Sulfat, mit einer Häufigkeit von nur einem Neuntel wesentlich seltener war. Die Bildung von Sulfoacetat, wie in R. palustris vorkommend, konnte dagegen unter den verwendeten Bedingungen gar nicht gefunden werden.
Ein durch Anreicherungskulturen isoliertes Bakterium, Acinetobacter sp. Stamm SW1, welches Sulfoacetaldehyd bildete und ausschied, wurde weitergehend untersucht, da dieser Abbauweg bislang noch nie beschrieben worden war. Die Reaktion von Taurin zu Sulfoacetaldehyd wurde vermutlich von einer Taurin-Dehydrogenase katalysiert, deren endogener Elektronenakzeptor allerdings noch nicht gefunden wurde. Die Identität des Produktes Sulfoacetaldehyd wurde durch drei verschiedene Methoden sichergestellt.
Zur physiologischen Untersuchung von Acinetobacter sp. Stamm SW1 mittels Wachstumsversuchen war eine quantitative Sulfoacetaldehyd-Messung unerlässlich. Da bislang jedoch lediglich eine qualitative Methode existierte, musste während der Diplomarbeit eine weitere Methode etabliert werden, die auch die Quantifizierung von Sulfoacetaldehyd erlaubte. Hierbei handelte es sich um einen Enzym-Assay, bei dem das zu messende Sulfoacetaldehyd aus Acinetobacter sp. Stamm SW1 mithilfe des Enzyms Sulfoacetaldehyd-Dehydrogenase aus R. palustris CGA009 in Sulfoacetat umgewandelt wurde. Die damit gekoppelte Bildung von NADH konnte in einem kontinuierlichen Enzymtest gemessen und das Sulfoacetaldehyd erfolgreich quantifiziert werden.
Ciliatin ist das Phosphonat-Analogon des Sulfonates Taurin. Die C-Sulfonat- und die C-Phosphonat-Bindung der beiden Substanzen besitzen ähnliche Eigenschaften hinsichtlich ihrer Stabilität. Es wurde in dieser Arbeit untersucht, ob sich während des Abbaus von Phosphonaten ähnliche Reaktionsmechanismen zu denjenigen beim Abbau von Sulfonaten finden. Hinsichtlich der Assimilation des Taurin-Stickstoffs wurden bereits mehrere Reaktionen untersucht, bei denen die stabile C-Sulfonat-Bindung nicht gespalten, sondern Ammonium auf anderem Wege gewonnen und ein Organosulfonat ausgeschieden wird. Im Gegensatz dazu waren für den Abbau von Ciliatin ausschließlich Abbauwege bekannt, die eine Spaltung der C-sulfonat-Bindung und anschließende Phosphat-Freisetzung beinhalteten. Analog zur Bildung von Sulfoacetat, Sulfoacetaldehyd oder Isethionat aus Taurin wurde überprüft, ob Ciliatin ebenfalls ohne Spaltung der C-Phosphonat-Bindung zu Phosphonoacetat, Phosphonoacetaldehyd oder Phosphonoethanol umgesetzt werden kann. Es wurden Anreicherungskulturen durchgeführt, und die daraus gewonnenen Reinkulturen wurden auf ihre Physiologie hin untersucht. Es wurde jedoch kein Organismus gefunden, der ein Phosphonat ausschied; die C-Phosphonat-Bindung wurde grundsätzlich gespalten. Somit zeigte sich, dass die Reaktionen zur Verwertung von Taurin und Ciliatin als jeweilige Stickstoffquelle recht unterschiedlich sind, wenngleich man aufgrund ihrer ähnlichen Strukturen und ähnlicher Eigenschaften der C-Phosphonat- bzw. C-Sulfonat-Bindung analoge Reaktionsmechanismen vermuten könnte.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Taurine is a widespread organosulfonate, occuring in the animal kingdom. Its stable C-S-bond can only be cleaved by microbes. Two major fates of taurine as a source of carbon or sulfur were known before I started my thesis: taurine sulfur can be assimilated via aminoacetaldehyde or taurine carbon can be dissimilated via sulfoacetaldehyde (SAA) to acetyl CoA in various bacteria. In contrast, only little was known about taurine as a source for nitrogen: In Rhodococcus opacus, the dissimilatory pathway is induced to utilize taurine as a source of nitrogen. In any of the described pathways, cleavage of the C-S-bond happens. Just befor I started my thesis, an organism was found (Rhodopseudomonas palustris) which didn't cleave the C-S-bond but formed (via SAA) sulfoacetate from taurine.
In my thesis, I investigated the pathway from taurine to sulfoacetate and purified (in part) the second enzyme in the pathway, the sulfoacaetaldehyde dehydrogenase (SAA-DH).
Enrichment cultures were done to find out how widespread the new discovered phenomenon is. The result was that I didn't find any organism who excreted sulfoacetate and unexpectedly only one who excreted sulfate. But several pure cultures formed SAA from taurine and didn't alter SAA at all, they just excreted the aldehyde. This was surprising because the aldehyde was initially thought to be very labile and reactive.
One pure culture of the enrichment set was identified as Acinetobacter calcoaceticus SW1 and growth experiments were done to study the taurine metabolism of the organism. SAA was identified by MALDI-TOF-MS. For growth experiments, SAA was tried to be measured by derivatisation and subsequent HPLC, but no quantitative measurement was possible by using this method. The reason was as follows: SAA can't be acquired by purchase but it was synthesized in the group as the bisulfite adduct. But this adduct can't be derivatized as good as the free SAA with this method. So there was no adequate standard for a standard curve available. I tried to oxidize SAA by boiling or by treating it with fuming nitric acid to measure the sulfoacetate which would be formed, but it failed: The aldehyde was too stable. Lately I tried successfully to oxidize SAA enzymatically with the enzyme SAA-DH from R. palustris (see above). A spectrophotometrical enzyme assay was established which now allows a specific and sensitive quantification of SAA by calculating the amount of NADH which was formed during the reaction from SAA to sulfoacetate.
Additionally to the experiments concerning taurine, enrichments with ciliatine, the phosphonate analogon of taurine, were done. All of the isolated pure cultures cleaved the C-P-bond and excreted phosphate. No organism was found which could degrade ciliatine without cleaving the C-P-bond and excretion of e.g. phosphonoacetate, phosphonoacetaldehyde or phosphonoethanol. Thus, the degradation pathways of taurine and ciliatine can be considered as very different although the two compounds share significant structural similarities.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Taurin, Ciliatin, Sulfoacetaldehyd, Rhodopseudomonas palustris, Acinetobacter sp. Stamm SW1, taurine, ciliatine, sulfoacetaldehyde, Rhodopseudomonas palustris, Acinetobacter sp. Stamm SW1
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Zitieren
ISO 690WEINITSCHKE, Sonja, 2004. Taurin und Ciliatin als Stickstoffquellen für Bakterien [Master thesis]
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