Fluoreszenzmikroskopische Lebendzell-Untersuchungen der dynamischen Wechselwirkung von Polyethylenimin-basierten Gentransferpartikeln mit dem Cytoskelett und dem endocytotischen Vesikelsystem

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2009
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Live cell fluorescence microscopy of the dynamic interaction of polyethyleneimine-based gene transfer particles with the cytoskeleton and the endocytotic vesicular system
Forschungsvorhaben
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Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
Published
Erschienen in
Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Endocytose und der intrazelluläre Transport von Nanopartikeln bestehend aus Polyethylenimin (PEI) und DNS, sogenannten Polyplexen, in lebenden Zellen unter überwiegend mechanistischen Gesichtspunkten erforscht. Dabei wurden Techniken der Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie zur Verfolgung fluoreszenzmarkierter Nanopartikel und zur beugungsbegrenzten Abbildung von Zellstrukturen, die mittels fluoreszierender Proteine markiert wurden, kombiniert. Ein einzelmolekülsensitiver Mikroskopieaufbau mit beugungslimitierter Auflösung und Laseranregung bei drei Wellenlängen wurde hierzu geplant und erstellt. Die Methode der Einzelpartikelverfolgung liefert quantitative Daten über die Bewegung der Nanopartikel und über deren Umgebung. Durch die Kombination dieser Bewegungsdaten mit der simultan ermittelten Morphologie der zellulären Strukturen, mit denen die Nanopartikel wechselwirken, ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen, die Kenntnisse über die Ursachen der Polyplexbewegungen in allen Phasen der Transfektion, unter anderem während der Endocytose, zu erweitern.
Die stark heterogene Struktur einer Zelle bedingt einen raschen Wechsel der Bewegungsmodi eines internalisierten Nanopartikels. Für die Analyse dieser Bewegung ist deshalb die objektive, weitgehend automatisierte Segmentierung der heterogenen Trajektorie in Abschnitte mit jeweils gleicher Bewegungsform erforderlich. Hierzu wurde im Zuge dieser Arbeit ein neuartiger Algorithmus entwickelt, der ohne vorhandenes Wissen über die zugrundeliegenden Bewegungsformen Abschnitte mit ähnlicher Schrittlängen- und Schrittwinkelverteilung detektiert. Bei der Analyse dieser homogenen Trajektorienabschnitte kamen drei Methoden zum Einsatz: die "klassische" Analyse mittels der mittleren Verschiebungsquadrate, deren Verallgemeinerung auf das Spektrum weiterer Momente der Verschiebungen und ein neues Verfahren, das im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, basierend auf einer globalen Analyse der Trajektorienform mittels der Fourier-Beschreibung einer Kurvenparametrisierung.
Die Experimente wurden überwiegend an Huh7-Zell-Linien durchgeführt, die stabil Fusionsproteine aus dem fluoreszierenden Protein EGFP und einem weiteren Protein exprimierten, wodurch der Zellkern oder Strukturen des Cytoskeletts sowie des endosomalen Systems im Fluoreszenzmikroskop detektierbar wurden. Dadurch konnte in allen Phasen der Transfektion die Wechselwirkung der Polyplexe mit den entsprechenden Strukturen beobachtet und analysiert werden.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

This work presents research on the endocytosis and the intracellular transport of nanoparticles based on polyethyleneimine (PEI) and DNA, so called polyplexes, in living cells. For this single molecule fluorescence microscopy and single particle tracking techniques were combined. This allowed for the simultaneous observation of the gene transfer particles and the cellular structures they interact with.
Due to the heterogeneous structure of the cells the trajectories of the polyplexes resemble different modes of motion. An algorithm for the segmentation of such trajectories into phases of equal modes of motion is presented.
Experiments concerning the endocytosis of the polyplexes, their intracellular transport and their fate during mitosis in Huh7 cells with GFP labeled cellular structures are presented.

Fachgebiet (DDC)
540 Chemie
Schlagwörter
Particle-Tracking-Mikroskopie, Intrazellulärer Transport, Polyplex, Polyethylenimin, particle tracking fluorescence microscopy, gene transfer, polyplex, polyethyleneimine
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690BAUSINGER, Ralf, 2009. Fluoreszenzmikroskopische Lebendzell-Untersuchungen der dynamischen Wechselwirkung von Polyethylenimin-basierten Gentransferpartikeln mit dem Cytoskelett und dem endocytotischen Vesikelsystem [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Interner Vermerk
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Prüfungsdatum der Dissertation
September 18, 2009
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Ja
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