Multiple challenges in protein structure determination by X-ray crystallography : Four ventures, one structure solved

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2009
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Vielfältige Herausforderungen der Röntgenstrukturanalyse,Vier Projekte, eine gelöste Proteinstruktur
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Dissertation
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Zusammenfassung

Beside DNA and RNA proteins display the basic modules of all cells in nature. Within an organism they take multiple tasks. Hence, they not only confer stability and structure to the cells, but are maschines on molecular level. For example, they mediate transport, catalysis, defense and the recognition of signal substances. However, proteins can also cause extensive damage as toxins, pathogenic structures or by alterations of their genetic code. As a result devastating dysfunctions like spontaneous or inherited diseases can occur that affect the whole organism. This is the case for the neuronal cell adhesion molecule L1. Mutations in the genetic code lead to the so-called CRASH syndrome, that largely influences the lives of persons concerned. One project of this work was to identify a suitable expression system for the first four Ig domains of E587-antigen of the gold fish, that is orthologous to L1, to express the protein fragment for later x-ray structure determination. Another example for a serious malfunction on protein level is the auto-immune disease Myasthenia gravis. Here point of action is the nicotinic acetylcholine receptor that has an important role in signal transduction. The receptor is recognized by auto-antibodies and thus flagged for degradation. In order to improve the crystallization of the transmembrane receptor, monoclonal antibodies were generated. The latter should bind selectively to the extracellular hydrophilic part of the receptor, augment this part to amend the crystal contacts between the receptor molecules.
Another two ventures of this dissertation deal from the pathogenic character of two bacterial proteins. One of them is the lysin-N6-hydroxylase of E.coli, that contributes to the biosynthesis of the siderophore receptor aerobactin. Siderophores serve lots of microorganisms for iron uptake, that is essential for their metabolism. Within this work, large surface exposed amino acid side chains were mutated to small side chains to facilitate crystallization. The second protein, the beta-N-acetylglucosaminidase BsNag3A, stems from the gram-positive organism B.subtilis. BsNag3A is engaged in cell wall degradation and recycling. It cleaves the beta-1,4-glycosidic linkage between GlcNAc and MurNAc of the murein. Within the current work the protein could be crystallized in two different ways, with and without its effective inhibitor PUGNAc. Both structures give insight into the active site and the mechanism of the protein.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

In der Natur stellen die Proteine neben der DNA und RNA die Grundbausteine aller Zellen dar. Sie übernehmen im Organismus vielfältige Aufgaben; so verleihen sie nicht nur den Zellen ihre Struktur und Stabilität, sondern sind vielmehr Maschinen auf molekularer Ebene. Sie sind beispielsweise zuständig für Transportprozesse, Abwehr, Katalyse, Pumpvorgänge und die Erkennung von Signalstoffen. Aber so sehr Proteine dem Leben zuträglich sind, so großen Schaden können sie auch verursachen, zum Beispiel in Form von Toxinen, pathogenen Proteinstrukturen oder durch Veränderung ihrer genetischen Grundlage. Die Folge sind oftmals verheerende Störungen, die den gesamten Organismus betreffen können, und die als spontane oder erbliche Krankheiten letztlich ihre Ausprägung finden. Dies ist zum Beispiel der Fall für das neuronale Zelladhäsionsmolekül L1. Mutationsbedingte Veränderungen führen hier zum sogenannten CRASH-Syndrom, das die Lebensqualität der Betroffenen stark beeinträchtigt. Ein Projekt dieser Arbeit war, für die Ig Domänen I-IV des L1 Orthologs aus dem Goldfisch, E587-antigen, ein geeignetes Expressionssystem zu finden, durch welches das Proteinfragment sowohl in ausreichender Menge als auch in nativer Faltung zeitnah exprimiert wird für spätere Kristallisationsversuche. Ein weiteres Beispiel für eine auf Proteinebene gravierende Störung im Organismus ist die Autoimmunkrankheit Myasthenia gravis. Angriffspunkt dieser Krankheit ist der humane nikotinische Acetylcholinrezeptor, der eine bedeutende Rolle in der Signaltransduktion spielt. Durch die Bindung körpereigener Antikörper an den Rezeptor wird dieser markiert und somit sein Abbau getriggert. Um die Kristallisationseigenschaften des transmembranären Rezeptors zu verbessern, sollte innerhalb dieser Arbeit versucht werden, monoklonle Antikörper zu generieren. Diese sollten gezielt an den extrazellulären hydrophilen Bereich des nAchR binden, ihn dadurch vergrößern und somit für bessere Kristallkontakte zwischen den Proteinmolekülen und verbessertes Kristallwachstum sorgen.
Zwei weitere Projekte dieser Dissertation beschäftigen sich mit dem pathogenen Charakter zweier bakterieller Proteine. Zum einen handelt es sich um die Lysin-N6-Hydroxylase des Gram-negativen Organismus E. coli. Sie ist an der Biosynthese des Siderophor-Rezeptors Aerobactin beteiligt. Siderophore dienen vielen Mikroorganismen zur Aufnahme von Eisen, das für ihren Stoffwechsel essentiell ist. In dieser Arbeit wurde durch Mutation von großen oberflächenexponierten Aminosäure-Seitenketten hin zu kleinen Seitenketten versucht, die Kristallisation zu erreichen. Darüber hinaus wurde die Ursache des Nicht-Kristallisierens untersucht.
Das zweite Protein, die Beta-N-Acetylglucosaminidase BsNag3A, stammt aus dem Gram-positiven Organismus B.subtilis. BsNag3A ist beim Zellwandabbau und -recycling beteiligt; es spaltet die beta-1,4-glykosidische Bindung zwischen GlcNAc und MurNAc des Mureins. In dieser Arbeit konnte das Protein auf unterschiedliche Arten kristallisiert und dadurch zwei seiner Konformationen gelöst werden. Zum einen das Protein alleine, zum anderen im Komplex mit dem effektiven Inhibitor PUGNAc. Die beiden Strukturen ermöglichen Aussagen zum aktiven Zentrum und zum Mechanismus des Proteins.

Fachgebiet (DDC)
500 Naturwissenschaften
Schlagwörter
BsNag3A, E587-antigen, Lysin-N6-hydroxylase, monoklonale Antikörper, nAchR, x-ray crystallography, monoclonal antibodies
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Zitieren
ISO 690FISCHER, Stefanie, 2009. Multiple challenges in protein structure determination by X-ray crystallography : Four ventures, one structure solved [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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November 13, 2009
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