Cyclic GMP in the development of the social amoeba Dictyostelium discoideum : Regulation of Calcium homeostasis by cGMP.

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Datum
2004
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Lusche, Daniel Felix
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Dissertation
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Zusammenfassung

In the work presented here it was shown that cyclic GMP is involved in the signalling pathway of the chemoattractant cAMP. Utilizing a strain (PdeD-KO) deficient in the cGMP-specific phosphodiesterase that shows a prolonged and elevated cAMP-induced cGMP transient it was found that cGMP negatively and developmental time-dependently regulates cAMP-induced Ca2+-influx. Cyclic GMP also delayed Ca2+-influx. Intracellular Ca2+-stores and Ca2+-pumps were not targeted by cGMP. By contrast, Ca2+-channels in the plasma membrane are likely to be the target of cGMP regulation. The inhibition by cGMP was confirmed by application of the cGMP-analogue 8-pCPT-cGMP in wildtype cells. Moreover, inhibition was also achieved by known mammalian inhibitors of cGMP phosphodiesterases, although surprisingly there was no prolonged and elevated cGMP transient. I showed that two of these substances investigated, SCH 51866 (SP) and Sildenafil Zitrat (Viagra®) directly compete with cGMP for a cyclic nucleotide regulated and Ca2+-permeable channel (CNGA3). This effect was specific, since a Sildenafil derivative, UK 114,542 did not inhibit the channel and since a cAMP-induced K+-channel was not inhibited by SP. This was also true for the cGMP-binding site, since there was no effect of SP on the activity of a cGMPdependent proteinkinase. Another convincing evidence for a Ca2+-channel at the plasma membrane to be a target of cGMP was the lack of SP-inhibition of Ca2+- influx in PdeD-KO cells. By searching the available databases I identified the sequences of three Ca2+- channels, whereby two of them could be targeted by cGMP: A Ca2+-channel similar to Ins(1,4,5)P3-receptors of the endoplasmatic reticulum, a mechanosensitive channel (Ms-channel) and a two-pore channel (TPC). The analysis of the TPC was launched. DdTPC is present with a single copy within the genome of D. discoideum. Northern blotting and RT-PCR revealed that its mRNA is expressed late in development. Thus, DdTPC seems to be necessary for late development, possibly for prestalk and prespore differentiation. The channel responsible for early development might be the Ms-channel. In the last part of this work cGMP was established as a regulator of light-scattering oscillations besides cAMP. PdeD-KO cells displayed oscillations with elevated amplitude and shorter period lengths. By contrast, a mutant, CAP-KO, with a Summary reduced cGMP transient, showed reduced amplitudes. The mechanism of the oscillations was furthermore revealed by the aid of the calmodulin antagonist W7 showing that cAMP synthesis is coupled to Ca2+. The link is based on release of Ca2+ from acidic Ca2+-stores. W7 transiently inhibits the proton-pump causing additional Ca2+-release. Ca2+ activates Ca2+-dependent phospholipase C, which is a key enzyme in the cAMP-elevating pathway. The light-scattering oscillations are therefore the result of concerted action of cAMP, cGMP and Ca2+. Note added in proof: shortly before the final version of this work, the remaining fragment of DdTPC was cloned.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

In der hier vorgelegten Arbeit wurde gezeigt, dass zyklisches GMP als second Messenger in dem Signalweg des chemotaktischen Botenstoffs cAMP eingreift. Mittels einer Zelllinie (PdeD-KO), der die cGMP-spezifische Phosphodiesterase fehlt und die sich durch einen erhöhten und verlängerten cAMP-induzierten cGMP Transienten auszeichnet, wurde gefunden, dass cGMP den cAMP-induzierten Ca2+-Einstrom entwicklungsabhängig negativ reguliert und den Ca2+-Einstrom zeitlich verzögert. Intrazelluläre Ca2+-Speicher und dort befindliche Ca2+-Pumpen konnten als Wirkungsorte für cGMP ausgeschlossen werden. Im Gegensatz dazu sind Ca2+-Kanäle in der Plasmamembran die wahrscheinlichen Angriffsorte der cGMP Regulation. Die Hemmung des Ca2+-Einstromes wurde durch Einsatz des membran-permeablen cGMP-Analogons 8-pCPT-cGMP im Wildtyp bestätigt. Es gelang ebenfalls, den Ca2+-Einstrom in Wildtyp Zellen mit bekannten Inhibitoren cGMP-spezifischer Phosphodiesterasen von Säugerenzymen zu hemmen, obwohl überraschenderweise keine Erhöhung und Verlängerung des cGMP-Niveaus auftrat. Ich fand, dass zwei näher untersuchte Substanzen, SCH 51866 (SP) und Sildenafil Zitrat (Viagra®) direkt mit cGMP um einen zyklisch Nukleotid regulierten Ca2+- Kanal (CNGA3) kompetieren. Diese Wirkung ist spezifisch, da ein Derivat von Sildenafil, UK 114,452,den Kanal nicht zu hemmen vermochte und der cAMPinduzierte K+-Kanal durch SP nicht hemmbar war. Dies gilt auch für die cGMPBindestelle, da SP und Sildenafil keinen Einfluss auf die Aktivität einer cGMPabhängigen Proteinkinase hatten. Ein weiterer überzeugender Hinweis, der für einen an der Plasmamembran befindlichen Ca2+-Kanal als direkten oder indirekten Angriffsort für das cGMP spricht, wurde durch das Ausbleiben der Hemmung des cAMP-induzierten Ca2+-Einstromes durch SP in pdeD KO Zellen erhalten. Durch eine Untersuchung vorhandener Sequenzdatenbanken wurden drei Ca2+- Kanäle identifiziert, von denen zwei als Ziel für cGMP in Frage kommen: Der Ins(1,4,5)P3-Rezeptor ähnliche Ca2+-Kanal des endoplasmatischen Retikulums, ein mechanosensitiver Kanal (Ms-Kanal) und ein Zwei-Poren Kanal ( two-pore channel, TPC). Mit der Analyse des TPC-Kanals wurde begonnen. DdTPC ist in einer Kopie im Genom von D. discoideum vorhanden. Northern Blot Analyse und RT-PCR ergaben, dass seine mRNA in späten Entwicklungsstadien von D. discoideum exprimiert wird. Der TPC scheint also in einer späten Phase der Zusammenfassung Entwicklung von D. discoideum gebraucht zu werden, möglicherweise für die Differenzierung von Prästielzellen und/oder Präsporenzellen. Der Kanal, der für Ca2+-Einstrom in frühen Entwicklungsstadien verantwortlich ist, könnte vielleicht der Ms-Kanal sein. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde cGMP neben cAMP als Regulator von Lichtstreuungsoszillationen etabliert. PdeD-KO Zellen zeigten erhöhte Amplituden und eine geringere Phasenlänge dieser Oszillationen. Die Amplitude war dagegen reduziert in einer Mutante, CAP-KO, mit reduziertem cGMP-Transienten. Der Mechanismus der Oszillation wurde mit Hilfe des Calmodulin Antagonisten W7 weiterhin um eine Kopplung an eine Ca2+-induzierte cAMP Synthese weiter aufgeklärt. Die Kopplung wird über die Freisetzung von Ca2+ aus sauren Speichern erreicht. W7 hemmt vorübergehend die Protonenpumpe, was zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+ führt. Ca2+ aktiviert dann die Ca2+-abhängige Phospholipase C, die ein wichtiger Bestandteil des zur Erhöhung des cAMP führenden Signalweges ist. Die Lichtstreuungsoszillationen sind somit ein Resultat des Zusammenwirkens von cAMP, cGMP und Ca2+. Anmerkung: Kurz vor Abgabe dieser Arbeit wurde die genomische Sequenz des DdTPC durch Klonierung des fehlenden Stückes komplettiert.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Entwicklung, Amöbe, Kalzium, Development, Amoebae
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690LUSCHE, Daniel Felix, 2004. Cyclic GMP in the development of the social amoeba Dictyostelium discoideum : Regulation of Calcium homeostasis by cGMP. [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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May 7, 2004
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