Functional analysis of the ubiquitously conserved protein GCP1 from Escherichia coli

Abstract

GCPs sind als vermeintliche Glykoproteasen, die in allen Lebewesen mit bekannter Genomsequenz vorkommen beschrieben. Dabei ist die Aminosäuresequenz der Proteine hoch konserviert. Sie beinhalten zwei Histidine, die das vermutliche aktive Zentrum der Protease darstellen, und eine C-terminale HSP70-aktin Domäne.Während dieser Arbeit wurden verschiedene Experimente zur Aufklärung der molekularen Funktion von GCP1 in Escherichia coli durchgeführt. Daten aus einer Computeranalyse der Aminosäuresequenz zur Membrantopologie deuteten darauf hin, dass GCP1 über zwei transmembranäre Helices in die Cytoplasmamembran integriert ist. Unter Verwendung eines in dieser Arbeit erzeugten Antikörpers gegen GCP1 konnte gezeigt werden das GCP1 wachstumsphasenabhängig reguliert wird und während des logarithmischen Wachstums in der Zelle akkumuliert. Das Protein liegt dabei sowohl löslich im Cytoplasma, als auch mit der inneren Membran assoziiert vor. Im Gegensatz zu anderen Wachstumsphasen befindet sich der weitaus größte Teil des Proteins während der frühen logarithmischen Phase an der Membran. Die HSP70-aktin Domäne des Proteins wurde auf die Interaktion mit möglichen anderen Proteinen hin untersucht. Es konnte dabei gezeigt werden, dass GCP1 direkt mit dem Zellteilungsprotein FtsZ interagiert. Es wurde gezeigt, dass eine gcp1 Deletion in E. coli zur Einstellung der Zellteilung und des Wachstums führt. Aus einer daraufhin konstruierten konditional letalen gcp1-Mutante wurden Hinweise auf die physiologische Funktion des GCP1 Proteins gewonnen. GCP1 liegt in der Zelle nur in geringer Konzentration vor. Selbst bei Deletion des gcp1-Gens ist diese Konzentration noch ausreichend, um einige weitere Teilungen der bakteriellen Zelle zu ermöglichen. Unter Verwendung einer FtsZ-Gfp Fusion, in Kombination mit der konditional letalen gcp1-Mutante, konnte gezeigt werden, dass die Depletion von GCP1 dazu führt, dass sich der Zellteilungsapparat nicht ausbilden kann. Ein spezifischer Nachweis von lebenden und toten Zellen zeigte, dass die Depletion von GCP1 die Zellen nicht tötet, sondern nur das Wachstum, bzw. die Zellteilung blockiert. Der Vergleich des Proteoms von GCP1-depletierten Zellen mit Kontroll-Zellen zeigte, dass trotz der Depletion von GCP1 weiterhin Proteinbiosynthese und Transkription abliefen. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass GCP1 bei der Zellteilung von E. coli eine wichtige Rolle zukommt.